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本帖最后由 细胞海洋 于 2014-10-24 09:51 编辑 & Z; i, z! B$ b. A6 v8 S; s
, V8 b: C- B8 B( S0 {
在此省略实验试剂和仪器设备步骤
& ]' \2 T+ f& X& m& z/ F成纤维细胞的制备
" z. {$ }. R, l1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies* ~# _" l9 Q w$ a% ]
A 时间：15d
3 Z& ^) L% `) O（1） 通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。- M L: ?. y- S H. D7 t! m8 ~
（2） 用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除7 m$ W1 ]. u! n" O2 n
（3） 将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min 3 Z9 h" `, w! i6 X! y/ G
（4） 另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
' l, S t6 X5 Q（5） 加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
1 V s5 \6 ^0 M3 [) ~（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
% {! s2 ~* Z( j（7） 细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1). e u/ g5 v" H' ?4 [3 |( z2 j+ v
（8） 第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
* I! P9 }# @& P' v& v2 f（9） 当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
; `# A) w' p6 w" |& [; s# _0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。- T& K5 v0 @6 k8 ]
6 u) e2 N8 d/ S' Z6 ~9 I尾尖（B）时间：10d! n6 n1 y6 A# f
在此略, C( a- }" F; j- J, Q8 W
解冻 SNL cells TIMING 0.5 h
9 ~, q; s$ k3 W+ o; N* l（1） 准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
. r1 g- M" E+ p9 |% K [% N（2） 从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
+ p: A9 v: }$ ]' \( o（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）* }7 C/ T. a/ ^
（4） 160g 离心5 min，弃上清
% q2 z6 v5 A) y) o% U) b（5） 用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2; W/ U! M: T) ^- {
孵育，直到达到80–90%汇合
9 d2 n5 k7 C" j9 w2 ]* e& ~) y5 @6 d5 M; k) v' r- u
CRITICAL STEP 不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。: C1 K3 G. m3 t4 ^# f6 j
) P* k8 E3 Z) ~& a8 h
SNL cells的传代 time：0.5h& s4 ], u# f( _0 @( d2 W( c, N7 B
（1） 弃培养液，用PBS清洗细胞一次
. c' j( y; l7 m4 B |- q（2） 吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min
* X i7 T5 D, l（3） 加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
" a4 t0 r1 g, I9 m% n（4） 通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
) v R: @" B% V5 ?0 O" x9 n4 h! v( [" R9 ~8 O9 Y5 p
Mitomycin C-inactivation of SNL cells TIMING 3 h! s' T6 o# f/ {* E
（1） 直接加0.3ml 0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1
; D# Z. z7 v% T; c$ h（2） 孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
& V, L" l/ ?3 j3 Q9 O（3） 吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min
- j0 [& [9 Q K5 p$ J（4） 加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
4 ~$ x6 V5 n4 b5 M! A* U% n( h（5） 细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.3 F5 E a* d/ r4 O% A- R
PAUSE POINT
8 `" h: j( W6 i. SThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周8 S/ D8 J- e2 ?, L) i6 i5 M+ r( E* `; T
$ g8 B* J% O; z* S, m; U( }解冻 Plat-E cells TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）) X$ z5 {1 y/ y" t
（1） 准备9ml的FP medium于15ml的tube中
5 L( F! I! s: r1 ^, ]$ C5 O（2） 从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）: r) d0 y& s9 ~, K/ w j
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）. r T! U p$ N( N1 J
（4） 160g 离心5 min，弃上清
`! @: G; X# B（5） 用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
+ J6 n4 f; i; n* h+ L1 J0 j/ X% C p（6） 第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
& B1 q& z% J( |4 Z: o6 d
2 w5 g: @8 t1 U7 }; SPlat-E cells传代 TIMING 0.5h" @8 u$ f+ P& Q3 g5 o' p9 ^
（1） 吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清; \. G8 K' Z% j5 r* x! s
（2） 加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
% V3 z( y' H+ {( V7 y2 K0 oDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h
. t% h" a$ j, P, L& Q（1） 用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
) c5 _, g+ P) s6 z) P8 F（2） 之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S9 y( D, o* |, h E% n: q) r h
（3） 180g离心5min! a5 T0 n1 D% R
（4） 弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
% p, `8 B0 r2 r1 j8 v（5） 细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml
' s' C5 Y7 X) ]（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2. v! o) \: ?7 ~/ z3 p$ o
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h
0 N1 q4 Q! ^/ ?, |* g（1） 移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube* }+ M3 ]- J# d( Z b6 A/ M, c/ D
（2） 在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min$ R* U; A: g& H3 t
（3） 加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
% \! y! A$ E& @1 m# v（4） 逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜6 }9 J* ?2 b5 {1 H Z1 ^; K
$ {: f" J) ?' w
关键步骤
2 y" S( ?0 v* J. a. ?" ^0 ^. uAlso transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction3 a) I- E, q0 u8 W; C, D6 l
+ n0 c5 r* C' T' t1 p+ FDay 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h
- U5 C" y' }4 m! C0 u吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
8 I4 R3 d" O: l- Q8 }* VPreparation of fibroblasts TIMING 1 h) `2 ]5 j- ?7 o% f% n( v% x, @
（1） 培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）2 |2 ?" Z) U/ c7 i
（2） 吸出培养基，用10ml的PBS清洗
4 Q4 P; Y" K% F' G1 Z x: q（3） 弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min+ y( W, ~* ^, ]& n( ?4 V3 x
（4） 加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中. s3 a9 Y F: f+ Y% c0 o; O& V
（5） 细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。; w+ K: p/ A/ U B) `" f$ W& M
Day 4: retroviral infection TIMING 0.5 h- Y& j# o+ x$ K1 O
（1） 用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
) f- j$ L4 q# O% c5 Y, I* x（2） 加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
/ y) c& ]4 u- I8 q4 J" p0 M（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
8 f% s5 c2 x8 w0 U2 F关键步骤) v- f6 B5 |- x4 V1 `& g* |
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度
2 i9 {3 p( G* |4 O8 _ [0 h" P; ]* P- b& R3 P) H; [2 }
（4） 从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
" Q& I/ v0 H) \( U) t2 S4 S0 ]# L
Day 5 and 6 TIMING 5 min each day6 ^1 ], J4 R3 Y
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS, o5 M; J) x% `1 t# u3 L5 n
Day 7 TIMING 5 min7 b4 b J3 N0 b4 k/ m. Z Q5 |4 k
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
2 _' r. s* d* e! TDay 8–10 TIMING 5 min each day
2 D4 K5 H9 x# m% ]每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
; s! H( [ M$ `; J0 E/ D0 E6 wDay 11 TIMING 5 min
0 V" u+ m% r4 g' U6 s For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
4 g5 o/ v. Z1 F1 o1 cDay 12 TIMING 约5 min each day7 P! f/ i: F X
每天换液，直至colony becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）$ z2 r) p! Z& o: x* M
Counting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d
5 k! Y4 g$ H8 r- k P（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min9 z( j' h* Q: B) R6 s: i1 k
（2） Wash the dishes twice with water.
! j: u( K( ^ ^) e2 ^* \（3） 加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min @" C. @: ?& J. V. u0 h* H
（4） Wash the dishes with water
/ H: D) h; _. ^, A/ k% @ U（5） Photograph the dishes and count the number of colonies.2 m" z2 E4 M4 ]; B+ f/ ?+ F& J! A
9 a W. I% L9 {( q) O
Expansion of iPS cells TIMING 1 h! t, K7 I& ]' ^: J
（1） 弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
. i1 F9 l3 d7 m8 H. x# ~( O（2） 彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
5 ]' Z+ X$ m0 l（3） 加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
- T( |" [: u, C. J) M（4） 将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）7 R2 ] M3 @" A4 q0 a
Preparation of freeze stock TIMING 1 h
% a2 B( p. t1 c: ?6 a) ~( U（1） 弃培养基，用2ml PBS清洗, u% V0 {" q7 O3 G
（2） 彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min; Z0 Z8 x5 y! I# u
（3） 加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层& K# S4 Y; m- Y
（4） 将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min; L, e3 b5 \3 m M8 i
（5） 弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml1 D) ]: J0 K% m% [- ^$ n' z/ [
（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）
- y( g+ Q" A: w（7） 加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
/ D. J# W/ W+ E5 U% a9 I( o8 Y（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）/ b+ P1 |- }. X7 n8 _
PAUSE POINT3 A& c. ^* u( r, d. ~( O* ~ }5 [
For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
& r' s: K" c" A0 G- G( } |
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发表于 2011-6-10 09:06
