WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

zhenhua

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: n$ g2 L+ ^' G2 |1 |7 K3 w2 d2 d# t( {: q9 U! w5 u
20ul足够。, q  K% y# b( J/ o7 t
煮20-30分钟不会使蛋白降解。& Q) [2 S  V9 _) M9 S0 w4 S
不用离心去沉淀。煮完几乎没有沉淀了。8 N3 f, g7 d) c( R
可以用actin等高丰度蛋白试试效果。
3 P7 Y- B" J0 G- W9 r6 p

mayansen1314

我看阁下做得好多了，请问最上边的几个条带是内参么？用的是什么内参？哪个公司买的？你上样上的是细胞蛋白还是组织蛋白？

lifangamanda

zhenhua 发表于 2011-6-13 21:25
  Z# x* h2 ~! _( |5 a( T3 u呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？- S' g8 L1 q& s
6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
' V$ v3 A& y% p. f+ r! k  X ...

5 I# ?* [% E+ f  y9 l
请问煮样20-30min，温度？

hndxws

回复 7ubo 的帖子) `; f" _7 N0 |# v5 j2 F9 u  T
* ~0 @: e$ b, f' ?( T# N
带GFP的小鼠囊胚

Learner

回复 7ubo 的帖子- K/ Q; X5 N+ D; P! ]( P
4 Y  s! z( P. @3 d: n  G
蛋白会变性但不会降解，预防降解可在细胞匀浆时加入蛋白酶抑制剂并在冰上操作。

张也行

回复 hndxws 的帖子$ G$ |% }" u* Y7 T! \  A

+ [5 l! M. S* g一抗加多的话应该整个片子都有涂抹吧，你这个不是只有条带附近的涂抹吗？

7ubo

回复 hndxws 的帖子5 P, K4 l3 _- ^7 t6 \$ y, N: O- Z
- @* h1 ^* `# B+ O. J# I
朋友，你的头像是一种带GFP的膜蛋白吗？GPCR？

shuixiao

回复 7ubo 的帖子9 N* x0 |( Q& [5 Y+ @9 u; X, O

2 `3 j+ @0 [1 t( U2 [9 OBCA 定量就行，不麻烦，有专门的定量剂盒，按照说明做就行。
; V0 ~; X9 f7 R; J我记得你说过怕上样量少了显不出条带来，一般Western可以检测出ng级别，挺灵敏的。如果真的是表达量很低的话，可以采用胶片曝光的方式显色，自己控制曝光时间，低表达量蛋白延长曝光时间，有同学曾经曝光30min，效果挺不错的。你右边那个图片做的还行，如果下面那条带是内惨的话，好像有点不齐，说明上样量不大一致。

hndxws

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) p1 ]0 T8 D! ]( R1 k6 g( h+ N$ j. a# l' ?4 g
我的样品和上次的是同一管样品，只是上次的蛋白内参定量差别有点大，想再做一次跑个漂亮的图，所以我觉得也不是蛋白的问题。不知一抗加多了，会不会这样？

张也行

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& k$ X! y$ L" ^* `  m9 b% A# [2 t7 r) d4 T% z8 t4 J
我也赞成不是封闭的问题，毕竟其他地方没有杂带或涂抹啊。但是你的蛋白质弥散了，个人感觉是蛋白质样品有问题，（你加够PMSF了吗？裂解超过1h，还要再加）或者你跑胶的时候电压不稳定，或者转膜的时候温度有点高。