WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

zhenhua

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5 N/ ^: K' A, r' G9 J9 g- ~! L) B! h% O! I" N: @
20ul足够。
( [2 ]4 r" D/ g) l' t煮20-30分钟不会使蛋白降解。
/ Q( \$ Y) D. R4 ~2 _. ~不用离心去沉淀。煮完几乎没有沉淀了。# D# P! v7 V; ~* j0 _* U; F+ v
可以用actin等高丰度蛋白试试效果。
, q& j2 N9 |8 i% b' Q

lifangamanda

Zhenhua版主，煮样温度，温度？？？谢谢！

wenyangapple

回复 7ubo 的帖子/ f* E9 P% n1 ]; B4 h
+ {, ]' b3 C2 m3 L- R" r$ v! w* r, v
右侧是好的结果吧？左侧比较糟糕的data最大的可能性没有裂解开，从上面那些黑色的渣滓量比较的大但是下面条带却很细能看出来。裂解buffer的问题可能是pH不对，或者是SDS or NP-40之类的加的不对。

wenyangapple

回复 hndxws 的帖子
; t  W7 B  R# Q+ O% u6 w# p
9 P  q( W. j* x" U1 J我觉得你这个是蛋白没有提出来，或者提出来的蛋白降解的比较严重。

pheebs

zhenhua 发表于 2011-6-13 21:25
# z, O; i% f6 r9 M* ]. o呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？% Q: L/ x* i9 J; l
6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？- s3 w/ @$ }- O; T! S
...

& `) X  Z) b7 W* {煮这么久，第一次听说。。。

细胞海洋

回复 lifangamanda 的帖子6 L/ H1 T/ M! w# _3 a
$ P8 o# S# y2 s& L* M
点击Zhenhua版回复帖中的回复按钮发言 像我这样 否则他不一定会看到

chb611301

我觉得先检查一下配的胶，是不是SDS和Aps的问提，胶凝的情况。其次是样品处理一般都是煮样15vmin，都没有问题了。我们常规经验脱脂牛奶封闭要2小时会比较好一些。二抗稀释浓度一般都是1:5000，到1:8000都可以的。

7ubo

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  T: p- b1 i( C
9 X) U$ J* I* \长满的6cm的皿的293T用200ul的SDS loading buffer裂解的，是不是加少了？

7ubo

回复 chb611301 的帖子* X) Q4 O$ A* ]" I) C% ?

3 t, R/ A3 d& k( l' U* f7 d3 i! M$ CAPS少加点是不是比较好？

lifangamanda

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* k+ P" q% Q. j8 Y6 ~# I# G* x1 e
多谢海洋哥！