WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

7ubo

2011-6-13 20:20 上传

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如题，6cm的293T用200ul loading buffer裂解的，煮过以后离心是有沉淀的。

shuixiao

蛋白浓度过高    每个孔道的上样量不应该超过60ug       过高的话 可能在煮沸的时候出现凝集        建议先定一下量

shuixiao

不知道你是用的什么显色方式？

7ubo

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4 M& }1 n$ h2 q  H) i0 B  K. B- w0 w1 a7 B
用什么方法定量？BCA？不会很麻烦吗？据说还要先作标准曲线。有没有简单一点的方法？直接测280？我用的是绿色荧光二抗，奥德赛扫膜。

aminhair

定量有专门的试剂盒的。可以方便使用。分光光度计定量偏差会很大。胶是买的还是自己做的？左面的还可以，右面的有点难看哦。电流或者电压调小一点，慢点电泳。

7ubo

回复 aminhair 的帖子2 B" t1 V4 U$ w) v

5 M* E" @) Z4 G2 A谢谢，自己做的

zhenhua

+ w. g- k1 h) `0 b8 n- {" o% x$ R& h( D8 D0 c1 q) n
呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？* w6 x# K2 i/ G
6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？  i+ f; U, B  o: D8 `5 R
如果不定蛋白量得话，每个泳道上50000-100000个细胞。' d) Z. Q6 Z: R9 g4 j8 O; a- ]& _
还有，你的样品很黏，条带拖尾，说明有很多DNA，而且DNA没有充分打断。
+ s" P1 ^7 ]" G这种情况，我一般要把样品煮20-30min，把DNA都打断了。你也可以试试超声的。
, e% N# H& E( A& V8 l最简单的方法是，每个泳道上50000-100000个细胞的量，样品煮20-30min.

7ubo

回复 zhenhua 的帖子% x: T' L7 G6 w% M

' r: ?$ f, }/ `: B; h  P* m- o每个孔上20ul。8 J" m+ @/ X: d( @
煮20-30分钟不会使蛋白降解吗？100度吗？

hndxws

; t5 S$ V5 z, h$ e) S" G

/ L; D' M- Q8 F5 O# t. G, K我遇见的问题也很郁闷。用的一、二抗体全是昨天的，而且昨天的条带都是好好的，今天跑出来就成这样了。好像显色都反向了，听人说这是因为二抗的HRP太多造成的，也有人说，这是封闭不好造成的。但是我觉得在我的实验里都不存在这些问题。我是用5%脱脂奶粉封闭了一个多小时，而且二抗昨天用没问题，请专家帮分析一下原因，最近这样的情况我遇见好几次了，太郁闷了。

细胞海洋

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