WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

张也行

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/ S  ]' H, u' q$ \) C
! o2 T: R" U" W0 v- M( k7 u直接用280不太准确。BCA其实不是很麻烦的，不到2h就能搞定。

张也行

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, q; L8 C; y. O$ c. _9 A" t2 p* G8 A& r& U% Y- |5 h
我也赞成不是封闭的问题，毕竟其他地方没有杂带或涂抹啊。但是你的蛋白质弥散了，个人感觉是蛋白质样品有问题，（你加够PMSF了吗？裂解超过1h，还要再加）或者你跑胶的时候电压不稳定，或者转膜的时候温度有点高。

hndxws

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" N( {& K' D6 Z2 n' N: w
我的样品和上次的是同一管样品，只是上次的蛋白内参定量差别有点大，想再做一次跑个漂亮的图，所以我觉得也不是蛋白的问题。不知一抗加多了，会不会这样？

shuixiao

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) z; y: O' u. q2 J' H8 t$ r9 }3 O& f1 Q' {! |4 d+ q
BCA 定量就行，不麻烦，有专门的定量剂盒，按照说明做就行。0 X  y" b% ~$ X  N9 v9 Z
我记得你说过怕上样量少了显不出条带来，一般Western可以检测出ng级别，挺灵敏的。如果真的是表达量很低的话，可以采用胶片曝光的方式显色，自己控制曝光时间，低表达量蛋白延长曝光时间，有同学曾经曝光30min，效果挺不错的。你右边那个图片做的还行，如果下面那条带是内惨的话，好像有点不齐，说明上样量不大一致。

7ubo

回复 hndxws 的帖子% e3 V1 U7 k' I) c

3 g3 w8 d* V+ }3 b& y朋友，你的头像是一种带GFP的膜蛋白吗？GPCR？

张也行

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" T1 N0 N! L- Q: H; Z$ @: o9 r: r; U& a
一抗加多的话应该整个片子都有涂抹吧，你这个不是只有条带附近的涂抹吗？

Learner

回复 7ubo 的帖子' Q% m2 m. k2 K" `$ x" [) X
' D* C+ N+ S6 n5 F
蛋白会变性但不会降解，预防降解可在细胞匀浆时加入蛋白酶抑制剂并在冰上操作。

hndxws

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4 c5 r! f- A) |5 v. h* ^& Y, M) L) e
7 ^& J7 `0 N8 |4 e带GFP的小鼠囊胚

lifangamanda

zhenhua 发表于 2011-6-13 21:25
. P/ q$ g& r+ m+ v! m2 ~呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
3 _& ]+ L) [$ {: d6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？" ~, o1 ^9 W' ?0 g
...

7 u9 h: o% z* j" R; b+ V% t7 O请问煮样20-30min，温度？

mayansen1314

我看阁下做得好多了，请问最上边的几个条带是内参么？用的是什么内参？哪个公司买的？你上样上的是细胞蛋白还是组织蛋白？