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yxc

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楼主

发表于 2011-6-23 22:26 |只看该作者 |正序浏览 |打印

【材料及准备】$ `8 r5 O# L' A. S& L4 e
1.一般的盖玻片，或专用爬片；
2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；3 x! \% O2 [5 H! s
3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。% F0 D6 H# N  [
4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。3 m9 Z. F6 I$ R0 t  P0 l
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。
6.常用的固定液
6.1丙酮可用于一般的免疫组化染色。" ^5 ?* H1 ]$ L; N% ?4 `4 ?7 D$ w
将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。, S9 z. `% [# J
* N5 N" D) g* t! Z
6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 . B3 n. j$ V) m1 s9 f5 U
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存6 J% E% k! n4 g$ O; c& s0 v3 Z. x

6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。
优点：穿透性强、抗原性保存较好。9 _9 u+ E6 T. c7 w+ H5 X
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度  Q+ K+ a  v8 T( D- v3 R
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存, s4 [& [% U1 |8 |

6.4 甲醛(福尔马林)应用最广
优点：形态结构保存好，且穿透性强，
缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。0 {' }. ]1 o4 q4 V, \3 S

【细胞爬片步骤】0 C6 A' A* t2 L9 t. g- e  c
1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。( |9 E2 K7 F2 Q$ B
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可+ ]9 x% J: [+ S% _% r
4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。

【细胞爬片的固定】6 |+ \1 Z. C" f% O
细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。' |& Z: e: @; T3 T
另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。- N% k6 g/ E( W7 W2 o2 T