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yxc

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楼主

发表于 2011-6-23 22:26 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

【材料及准备】
1.一般的盖玻片，或专用爬片；; P! t% U$ A7 G- J- r
2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；
3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。9 q5 e5 p. s, V
4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。) p- X' z9 T- g" ^8 y3 A. k
6.常用的固定液( a  o7 @8 ?7 f" Y" s9 J/ a
6.1丙酮可用于一般的免疫组化染色。4 ]$ j# p0 w7 Q  k
将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。

6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等; B) i$ F1 ?, q. ?: o9 N7 `
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存

6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。/ F& B9 U: X" k% \) P/ `2 T! n
优点：穿透性强、抗原性保存较好。
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度" p. B9 m; L+ Z- f  @- t, C% V
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
( N3 u2 g7 B4 ~8 P
6.4 甲醛(福尔马林)应用最广 * Y8 ]: m0 }/ S( A2 c
优点：形态结构保存好，且穿透性强，
缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。: w: N) q" Y7 \2 b* s/ M
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【细胞爬片步骤】' S, w; U2 ^8 L# O& N. I9 F) G. i
1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。2 m+ S3 I/ |: F! K6 I
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可5 G+ u4 D7 B; w1 h# H
4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。8 e2 c9 t( \9 d* h) o7 M9 @
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
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【细胞爬片的固定】" c% |2 S( Y8 b8 C  @+ f8 g/ s2 I
细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。6 i7 ^) q6 f8 j0 `
另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。
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