求原因。PCR怎么会多跑出一个条带？有图......

熊猫猫

今天第一次跑PCR，没用内参，只跑了目的基因(217kb)，左边是我跑的结果，为什么会多出一个条带来，而且比目的基因还亮些？# M: [( _; p- Z' g4 B2 X3 n
还请给位指点啊......

zhangyan813

回复 熊猫猫 的帖子% E+ @& a3 }( o. @( X/ k2 o$ I

/ `2 Z/ e* c- d" U你们那里有没有DNA和RNA浓度和纯度的仪器，就是紫外分光光度计，提好的RNA可以先上机测一下纯度，要是在2左右就应该很好。要是担心RNA污染DNA的话，可以在提取RNA的过程中加DNase.

yinjiqingqq

应该是非特异性条带，有可能是你设计的引物或是pcr体系不合适，你可以做Touch-down pcr吧，

daviddow

估计是引物设计的原因。可以P出来不同的基因

熊猫猫

回复 zhangyan813 的帖子7 D- {2 ^$ ^( r9 y2 X8 `

; ?9 ], D7 N, C/ A2 I& M( w% b您好，谢谢您和大家的帮助
& x) ?2 O5 N$ H3 Q这是我第一次跑RT-PCR，所以这张图上五个泳道的浓度是一样的，只是PCR时的退火温度不一样。
1 w$ `. |4 g( A4 w以前跑过RT-PCR的师兄也觉得是DNA污染，因为引物比对的特异性还是很好的。今天重新RT和PCR了，退火温度设置得要高一些，还是有杂带，只是没上次得亮和明显了。8 y: H0 r7 W# v0 O' C- \
下次就按照你的步骤试试哈，但会不会是在提取RNA的时候就被DNA污染了呢？如果这样的话，有没有办法检测RNA中被DNA污染了？

zxcv12345

回复 熊猫猫 的帖子
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4 ~7 o; H6 L. C9 Z0 C, T1. 不会是引物二聚体，分子量有点大
9 F% }6 }5 q! U2.应该用blast检测一下引物的特异性， 很可能是引物不特异。

zxcv12345

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/ ]4 p7 V2 i6 y# z1. 不会是引物二聚体，分子量有点大3 B/ s' t0 J* e6 X
2.应该用blast检测一下引物的特异性， 很可能是引物不特异。

langziforever

回复 jun8013 的帖子3 ~' o7 ~* b/ O) ~: C

2 o3 ^" _& K7 _! }' o这绝对不会是引物二聚体！

langziforever

首先楼主的问题就不对，这绝对不是多跑出一条带，而是你PCR扩增的问题，另外，你应该是217bp的长度吧？写错了，呵呵！
  [% E: G7 Z% x3 B4 S7 H另外看你8楼地回复，貌似你做的RT-PCR，如果是这样的话，有多条带也比较正常，毕竟mRNA可能存在多种形式的剪切或者不同转录起始位点，4 D1 c! X5 O  i2 V9 ]
建议你优化下引物，或者尝试nest-PCR！

pla269

正常有三条带5s、18s、28s，28s为18s的2倍左右，你的图不好说建议在跑一次