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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-6-30 18:19 编辑 2 I6 c; m1 @; p
9 n i3 [3 ^( s ]重编程机制的文献学习
8 d# G+ t3 z7 `+ u# G1 `/ `& T7 J& U6 k8 j& y
% d D% c' o+ j k* ~- [: T
细胞重编程从核移植发展到因子诱导体细胞为多潜能干细胞，技术与方法上可以说是发生了里程碑式的变迁。然而，对细胞重编程机制的理解
& p: {" p c5 `; }8 u1 j( ^2 y4 U仍处在一个比较浅的不成型阶段。一方面，以核移植和iPSC为标志的重编程研究在很大程度上一直是个现象学的研究领域，人们大部分注意力) a) r! T: m1 F, ?7 u
自然是放在这种现象的表现方式上。只有在经验与教训积累到一定程度时，对机制的认识的需要才会逐渐显现。到一定阶段，没有对现象背后! n3 d3 u/ P! ~9 o. T
的机制的系统理解，就无法进一步深入下去。如果以多利羊为哺乳动物核移植的第一个里程碑，11年后iPSC的出现标志着重编程的研究进入一
f) K; \5 _& j8 P y A( d个全新的阶段。而同时，因子诱导的重编程为从分子机制上深入理解重编程现象提供了一个必要的平台。
0 r+ j& p* \2 E% Q) V/ `! z2 [* X, \
在这个背景下，近两年出现了一些试图整合现有证据，提供具有指导意义的机制框架的努力。从发表在主要杂志上的重编程综述来看，无论是
0 a; X) d8 u' V) z) m- x文章数量还是关于机制探讨的篇幅，都有比较大的增加。各家的文章自然是试图利用现有实验证据来对可能的机制模式画图，这可以说是一种% K2 w- w* O7 T( @9 Z) S4 w! l+ e
“内视”的角度。这里则试图从这些文献的特点及其演变过程出发，看人们探索重编程机制的所经历的思路过程。可以看作是更接近于文献学
% q3 \3 W) F1 r, q% d. w习性的seminar，而不是试图综合现有的文献内容勾勒出一个mata-analysis。也可说是一种相对的“外观”。6 Y/ n3 M% @6 [+ f# B( | R
% r; v. ?6 O( @5 g
关于重编程的代表性综述文献选择，从iPSC发端之前关于核移植的认识开始，直到2011年上半年多篇最新文章，大约选了15篇左右，一些文章
1 E# C$ s7 ~" G) {: Y' c; }具有内在的延续性。综述文章中，关于机制的探讨篇幅和深度各有不同，早期的自然浅一些少一些，越到近期越深一些。首先对各文章中关于1 X' o( k- Z% O9 {- E1 w. |
重编程理论机制的探讨做一个大致的描述性摘要，在这个基础上试图总结出一些规律性的东西：现有公认的重编程机制的主要内容，以及关于; R" o2 [: \. X0 P7 C, K
重编程机制思考过程的一些特点及其历史演变过程。这两者往往是结合在一起的。
# Z& a9 p$ h$ k5 V- O
/ M" L8 ~3 b/ N$ u2 P0 P( X; ^所选择的涉及重编程机制的理论性文章，在侧重点，文章结构以及表达方式上多种多样，关于机制的描述层次也各有深浅，这种多样性也恰反$ |4 ^9 i) F& v! S
映了目前对所谓重编程机制认识的高层不确定性，也就是说尚不存在一个公认的重编程机制的理论模式。换句话说，对机制的认识还停留在寻/ R1 B. f/ x# d" S, F$ {
找合适的高层次理论框架上。
& Y( b, `1 O k1 G1 |2 j `( @4 b: N3 l; @2 N
. d+ e0 f) f, M+ Q% v( l
I。Nuclear reprogramming and pluripotency
2 J) f! k$ D# }* D; v6 {; c8 ?& n1 h$ x/ |7 X* t
Hochedlinger & Jaenisch 29 June 2006 Nature Insight Review, f0 Z9 {( F+ k X. v* n& O
- b) ^# D' _7 n. R Y! B( Y
这是发表在2006年鼠iPSC出现前夕的一篇关于当时的四种重编程方法：核移植、细胞融合、细胞提取物、培养条件诱导重编程的经典综述，某
2 r, W: q( T# j$ m4 d种意义上说提示了因子诱导重编程的出现。而且，比较明确地把细胞重编程与干细胞多能性结合在一起考虑。
' R9 x7 H+ T/ D! v: V7 l2 y4 B- Y0 Z* n; _9 m
该文梳理了上述四种经典“细胞核重编程”的现状后，认为重编程的演技仍然停留在“功能水平”，“现象水平”上，急需在细胞水平、分子 ~. D) O; Y% ?: A
水平和生物化学水平解构重编程的机制和过程。强调需要确认表观遗传在重编程中的作用机制，提出了细胞融合重编程中是否染色体被重编程
% R. t. k' T1 D# K. Q为多潜能的问题，细胞提取物重编程中Oct4的作用，培养条件重编程研究中PGCs-Oct4；imprinting erase的问题。
1 J* C# Y. x1 T& [
: } _9 i8 X$ n1 K) P2 j3 p在“Molecular mediators of reprogramming and pluripotency”标题下，对重编程的可能机制作了一些推断。讨论了ESC多能基因和条件在重编9 L' a ~) H& Z8 t
程中的可能作用：signal transducer、transcriptional factors在重编程中的可能作用。通过Oct4，Nanog和Sox2在体细胞核移植囊胚中有不完全
" u* `% @7 m' u( ?% s. l0 b, G激活而在胚胎干、EG或EC来源克隆囊胚中有正常表达的现象，提示这些多能因子在重编程中可能具有重要的作用。0 Y8 n7 l% J" n6 w
3 p% A" l9 K- D3 p) S# J
关于下一步的研究方向，该文提出：关键多能因子网络的很多下游基因同时也是PcG的靶子，这一点提示染色质conformation与上述因子相关。. M/ ~8 t4 A5 Q5 i, l _
与因子相关的conformation具有“双极域”特性——inhibitory histone H3 lysine 27 methylation marks and activating histone H3lysine 4
, G% J0 T" X. H1 }mechylation marks。这些双极域在分化细胞中丢失，提示其在维持ESC发育可塑性的作用。在分化细胞中，OCT4,SOX2和NANOG有可能与PcG3 O) C3 i# ^/ {% P' p4 Z
蛋白合作，一方面沉默多潜能状态的发育调控因素，同时，recruit表观遗传正面调控因子，激活分化相关转录过程。一旦搞清楚ESC的多能性( r2 u t* i7 \/ E0 O4 h5 X
和自我更新转录调控网络的分子机制，就有可能通过影响这个转录网络的关键步骤来重编程一种细胞类型为另一种细胞类型。
* d- [7 ^6 B2 c. x* u! H
8 t+ N) G, [& d$ VLooking ahead：有无可能不通过暴露细胞核到卵环境来重编程体细胞？能否找出重编程的基因和通路？因子诱导的体细胞de-differentiation的
! D3 h& o! v. \6 }例子，如外源性激活OCT4导致成年鼠前提细胞扩增并形成肿瘤，而turn off OCT4肿瘤消退。提示成年前体细胞是理想的重编程来源细胞。因此，5 \3 i5 A( y$ u$ C; u! ~; W
有可能采用功能增减策略，来鉴定有利于成体细胞重编程为胚胎干样细胞的因素。利用胚胎干抵制DNA甲基化丧失的能力来挑选重编程的细胞' p/ a& \& L* z
（其他任何细胞都不具备这个抵抗能力）。
! C3 x1 k2 x9 ?3 [& }, V
. M. M7 S# {1 ? p k. D非卵环境、重编程基因、外源性激活OCT4去分化，这已经是后来Yamanaka iPSC思路的雏形。关于重编程中涉及的基本概念都有了，不过还是; c) G- L/ c6 L) d, x
不连贯的，不完整的。
* b% L; v, i6 c, Q4 s) w1 U& u( k8 R/ Y2 D
有趣的是，Yamanaka鼠iPSC结果发表于此文两个月后：online August 10，2006 Cell。2 A: A; [( D( e
! V$ `6 T9 E) V! A4 y( v
3 y% l" M+ i5 n& n/ B( VII。Strategies and New developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells
5 S4 c3 A% [5 w2 V$ d2 [+ E5 A9 @" o5 B' \# l
Yamanaka, Cell Stem Cell July 2007 Review6 S- Z( n# B* }8 r, k9 J
/ l6 j5 G3 Y# X8 ?* a" m/ ]" d2 s2007年Cell Stem Cell发刊号上登载了Yamanaka关于iPSC的一篇Review，概述了鼠iPSC一年间的进展，在谈及可能的“机制”时采用了比较
2 X. H- J$ k8 N5 ^“朴素”的问法：' p, c- n2 ]" [4 f/ _8 [, t% j
7 z$ r W; ^( f2 ~; ?
How do the four factors induce pluripotent stem cells?6 m0 D( ?' u X' F( Z d
4 j! y# e% F# m
他强调胚胎干以及其他多能干与肿瘤细胞在很多方面类似，例如其永生性和快速增值特点。推测这可能是需要肿瘤相关基因c-Myc和KLF4来诱
0 h% _ e; A w6 |/ U* C% V导iPSC的原因。这两个因素本可以诱导细胞为肿瘤细胞，而加上Oct4和Sox2可能转移了变化方向，成了iPSC。推测关于iPSC低效率的原因之一，
& y6 |$ B2 D# @是来源细胞中少数progenitor被重编程为iPSC。另一个可能是还需要其他因素的参与，包括多能因子和染色质重塑因子如ISWI和Brg1。此外，" I' ]8 T) F# S+ W
各种因子之间的比例和表达模式的平衡很可能起关键作用，例如Oct3/4过度表达破坏多能性（看到了多能因子在多潜能性上的双重作用）。
: H6 x. i* U' G& | r$ h& N# ~. q
此文4个月后，Yamanaka & Thompson实验室关于人iPSC文章同时发表（online November 20 2007)。
- P5 x( s# n5 I3 ?
' x; l0 b; H9 @4 h3 _9 q M: ^2 r& p0 e' i( K+ `" i' C [6 N
III。The First Direct Reprogramming of Adult Human Fibroblasts y2 V8 v5 ^; n+ a
4 A: ~' }0 u* l: T7 X- @Ian Wilmut Cell Stem Cell 1, December 2007 Previews
: w0 z9 k( N- U) c+ v9 {) F
; t- y# L: A: m {$ T! f6 u2 A人iPSC发表一个月后，克隆羊之父Ian Wilmut在Cell Stem Cell上发表了一篇简短评述，指出iPSC是体细胞克隆的后续进展。并认为至少就直接; p. V; m/ Y6 B- _) W& u/ w$ p
重编程细胞而言，iPSC技术将很快使体细胞克隆技术失去价值。有趣的是，治疗性克隆（therapeutic cloning）也是在2007年首次得到证明。
/ d# e7 D M$ v& J8 t) J4 o/ `" q# k8 T& ~
关于iPSC的可能分子机制，Wilmut指出Oct3/4 and Sox2 可以上调多能性核心基因的表达，推测c-Myc 和 Dlf4 修饰染色质结构以使得Oct3/4* t0 W# z$ y8 V; g) \7 u9 P, p; L
和Sox2可以与这些关键基因结合。这一点与前述Yamanaka等人的推测一致，当然后来证明c-Myc等oncogenes不是必需的。
6 k8 C- m' u; s. Z2 [9 R' c1 Z8 D2 u! a
# e/ M! o' _& c8 l) BIV。Stem Cells, the Molecular Circuitry of Pluripotency and Nuclear Reprogramming
- v# [+ E4 G" @. u0 X1 T" U( }2 u) X: `1 a
Yaenisch and Young, Cell, February 22, 2008, Leading Edge Review
* T F4 n$ X$ T$ q, L5 T( Y$ H7 C; H+ v0 o ~3 y. ~
2006年iPSC出现后的不到两年时间内，因子诱导多潜能干细胞研究多在不停发现这个模式的一些新现象，比如四个因子的必要性，诱导过程的
* U$ G( h* I2 m. Q' r5 S# e中间状态等。如前所示，iPSC发表之前，Yaenisch关于核移植重编程的综述预示了iPSC技术的出现。一年多后，Yaenisch延续了前述综述的思路，1 P- s4 X" V2 g8 Z" C
结合iPSC的新现象，对多潜能和“核重编程”的分子通路进行了描述。重点围绕iPSC提出的新情况，列出了一些必须考虑的问题。- p# C) }1 w6 b% ]$ A$ m" L$ ~
1 | O( Y4 z8 X0 G: \1 H# |5 R& E
从核移植的角度，关键的机制问题是必须解释卵子细胞质内哪些“重编程因子”将体细胞的表观遗传谱转变成了胚胎细胞的表观遗传谱
; |) }* x- k5 v2 H3 s; K0 h/ L（epigenome）。 p2 Y( O" [ c; F
{, l- R, F: j& J$ n而关于iPSC重编程分子机制的理解，则首先要解释为什么外源性因子的作用是渐进性的，需要数周时间以及为什么只有小部分转染的成纤维细胞
# W7 r; u4 p9 g最终变成了iPSC。而且，下列的现象也必须得到合理的机制解释：（1）重编程过程包括中间细胞状态；（2多潜能状态多存在于胚胎-体细胞杂7 ~0 V4 A: a; H' p
合群落；（3）体外重编程涉及多次的DNA复制和细胞分裂；（4）全新DNA甲基化以及低甲基化可能在重编程过程以及多潜能维持中起着重要的2 t t- U6 F1 m1 d I
作用；（5）尽管不是必须的，然而c-Myc和Klf4可以提高重编程的效率及速度，有可能通过促进表观遗传修饰并激活内源性Oct4和Sox2自调节环
* w4 Z0 g2 N% Q$ U路来起作用；（6）在ES沉默发育调控机制中起关键作用的PcG蛋白以及组蛋白修饰，需要在重编程的细胞中重新表达，例如，PcG催化的H3K27me38 U0 M" }( [9 e7 X9 C8 u
染色质修饰在MEFs中缺失，但在iPSC中获得重建。2 B; W; J$ e% x0 f( B2 W* A+ L
, `3 @0 e1 ^' P6 g: s! W
) h$ B) H! ? W) eV。Epigenetic reprogramming and induced pluripotency% I' y: K9 n/ r1 K# o$ x
- [+ W( ?* I3 J, X/ B* [% F1 P! lKonrad Hochedlinger and Kathrin Plath，Development 136, February 15, 2009 . R4 W ^/ w3 J/ W( H
: y) P* v: Y1 G* B此文应该是Hochedlinger从Yaenisch手下出来后所写的关于重编程的较早综述。大框架仍是从历史发展的角度依次简述了导致因子诱导的细胞重# T' r, X6 T% m1 e2 u
编程的科学里程碑，总结了两年半左右iPSC研究的主要话题，如iPSC过程及其中间阶段，来源细胞的分化程度及其影响，各种诱导技术及其局限性，
% ~* Y. g" o! h8 i, A( E0 C0 p% U: x随机性表观遗传事件的影响，多能性重编程与细胞系直接转换的比较等。( p. V5 s$ q0 `% l8 m
2 X/ I3 [" b3 E! E. B6 n
关于转录因子诱导重编程的可能机制，着重讨论了不同因子的差别作用、维持胚胎干细胞多能性的核心通路在重编程中的意义、转录因子双重作
2 n6 P4 y0 a. T用：抑制成体细胞程序与激活自我更新与多潜能机制、通过自调控环路，外源性表达因子激活内源性因子等。此外提出，重编程因子也可能具有
+ W+ X) @$ @5 U2 P& E全局性的调控功能，例如c-Myc与DNA的复制以及histone aceylation等的关系。
* e- U* s+ @- v6 B! j. i( I1 r
; o* ^# k' k; d% [+ A+ B这篇文章以较大篇幅评述了iPSC研究过程中越来越突出的表观遗传因素，也许文章题目从Yaenisch的传统的nuclear reprogramming变为epigenetic
. `6 D" V l) W4 Q: `reprogramming并不完全是偶然。表观遗传因素在iPSC重编程中的核心意义可以从操作的角度分解为重编程的表观遗传“路障”以及克服这些路# d% q6 O4 n' O8 V) H
障的可能方法。同时，这些路障的克服，也就很大程度上解决了重编程的关键机制问题。: ], Z' ~8 d. k& D
% C! o( `; S b5 b) W- o& D. ^首先，成熟的分化细胞中Oct4的甲基化以及不存在Sox2的事实，提示分化细胞具有多重抑制机制起着沉默胚胎样（多潜能）机制的作用。重编程
% {. t9 B4 Q7 L1 g4 `1 I' d需要克服这些抑制机制。Oct4和其他多能性基因的沉默涉及3种主要的表观遗传抑制机制，即组蛋白乙酰化，组蛋白甲基化以及DNA甲基化。干扰7 x) {( b& x! a* i1 o, @
这些抑制机制，可以提升转录因子诱导的重编程的效率。这种抑制机制是通过直接结合多能基因的promoter区，还是通过其他间接作用，仍有待
' P. D5 z* \/ y6 ]研究。
; A, z6 W0 [: {4 ?% b1 }! I1 Z* Z! {8 c8 s$ N; A
此外，Nucleosome packaging以及某种抑制性染色质结构可能“隐藏”了四种重编程因子的胚胎干细胞特异性靶区，从而阻止了这些因子在重编
- V$ c' b y: m! J3 h程过程的早期的binding。而某些情况下，重编程因子本身可能具有某种改变染色质结构的内在能力。其他的可能情况包括重编程因子有可能被动" Z2 I% ~. O9 E4 t, j& |7 R3 n
地阻断维持胚胎干细胞多能性因子的抑制状态而发挥作用。
- h2 H! j3 W( t$ v+ `% n- F# n0 O' s) S' }# E
关于DNA去甲基化在重编程过程中的可能机制。一种情况是“被动”去甲基化，即在成体细胞周期的DNA复制过程中新获得的DNA的正常甲基化，1 J( e {" q. L7 ? m. M# Q( b
因为重编程因子直接与promoter or enhancer regions结合从而受到干扰。这一去甲基化过程可以是“随机的”，在较多转录因子与靶基因相关时( ^% ]% K9 T" N3 S0 ]% K5 H( c
发生的可能性比较大。或者，重编程过程需要主动的DNA去甲基化机制来重新激活多潜能基因。不过，主动去甲基化所需要的去甲基化酶在哺乳3 `; D1 N% S+ R
动物中是否存在及其程度仍存在很大争议。概言之，重编程过程中多能基因如何在DNA水平获得去甲基化——被动性或主动性——仍是有争议的' G! W) c p7 t+ ^! I7 D
问题。部分重编程的细胞可能提供了一个独特的平台，来鉴别上述可能性，并解构其他的染色质修饰过程。 " T; I' y u! m/ ~" g
! D( Z0 s5 }5 a9 B2 b
成年体内的细胞水平重编程主要是生殖细胞的重编程。比较PGC分化以及体外重编程的DNA去甲基化以及染色质改变机制，可能提供很多有价值
K* m. F, O2 c的信息并导致更有效和真实的重编程手段。# }5 {$ V$ F% T$ N. T
9 P: Q. O% U+ k" A3 O/ d
: P; s# p w" }0 s ^: z5 q9 WVI。 Induced pluripotency: history,mechanisms, and applications
0 W2 \( c. q, a: T& l; v
. [3 W9 q; I5 X; L$ ^Matthias Stadtfeld and Konrad Hochedlinger, Genes & Development, October 15, 2010
( b5 l' s/ L% h7 S( U& O g1 ]+ v2 E% K9 B t& r! Z
如标题所示，Hochedlinger这篇综述2009年2月的上一篇一脉相承，从领域发展过程引出对现有研究现象的机制探讨，整合了最新的一些进展，如# e( N' j/ v! z
标题所示，reprogramming更进一步指向了induced pluripotency。经过近五年的大规模研究，iPSC最突出的问题之一是其重编程的低效率。而这个
+ ^3 R* s9 I# N7 `1 V低效率所反映的则是需要克服的各种障碍，尤其是成体细胞表观遗传的障碍。同时，人们也在进一步考虑低效率所提出的诱导重编程模式问题，即% F! p; t2 j( `& `
少数“精英”模式和随机模式到底孰是孰非。在这篇文章中Hochedlinger等也提出，整合“精英”模式的部分要素后的修正性随机模式，可能更符! S2 Z% n# E2 n3 u
合现实，也就是承认可能部分细胞或状态更容易被重编程。
: _/ d' h' V4 @* Q% r
! p& F2 c/ ?$ Y: C1 a3 m$ j本文进一步列出了重编程需要跨越的“路障”，包括下调成体细胞markers, 类MET的形态学变化，激活多潜能性的早期markers如SSEA-1等，激活) t! @1 f+ ` B7 [, I
内源性Nanog或Oct4，还有经历数轮的细胞分裂，染色质修饰的全局性基因谱重塑，如DNA和组蛋白的甲基化从成体状态变为胚胎干类状态，以及; K4 l4 C6 y+ ^$ i( n/ p! }
克服部分成纤维细胞抵制重编程的问题，重编程因子消除成体细胞的内源性Nanog位点的抑制性表观遗传特性。3 `$ |3 }$ p4 t
# s) y4 l- C! p' _
成体细胞中被DNA甲基化所沉默的多能性基因promoters是如何由“被动的”或“主动的”NDA去甲基化所扭转的。一种可能是通过一系列细胞分% q, }; f* U: s, V& ?
裂过程，重编程因子拮抗DNA甲基化酶Dnmt1，从而消除其维持成体细胞DNA甲基化类型的作用，达到DNA甲基化渐次消失的目的。另一种可能的7 V: `( m" u1 w, h
情况是，某种未知的酶主动将核心多能性基因的DNA promoters去甲基化，相关的间接证据来自对生殖细胞的研究。8 `- z b7 r6 k8 ^# [# i; L
& C6 G4 z6 w. O
成纤维细胞如何在重编程过程中获得细胞永生性是另一类“路障”，这方面的提示来自于p53缺陷的成纤维细胞效应。5 G7 [" R, C; ]. S% U
% W) ]) j/ E# `/ O& A3 @# v6 K一个需要考虑的问题是，是否重编程为iPSC的过程也是“逆转”发育的过程，即成纤维细胞在获得多能性之前，是否要经历一个去分化为前体类细
0 f( s6 ?( v/ _! c* ]胞状态的中间过程。同时，也有猜测外源性多潜能因子的强制表达可能造成某些与体内前体细胞无关的“人为”细胞状态。
( p+ y* [" J+ c) q' q
+ z! X9 w8 n: o3 H重编程因子在表观遗传重塑过程中的作用。
8 _* V! D% @3 n& N9 R+ L
7 J; j, p& L1 t# O( d0 a$ j各个重编程因子是如何在诱导iPSC的过程中克服上述“路障”的，这一问题仍没有得到答案，一个原因是目前仍没有研究能够系统监测重编程过程# G5 H5 r9 S5 C3 ]5 D' }8 z+ I
中转录因子binding，染色质修饰，基因表达等在一过性重编程中间环节的完整图景。相关的证据基本上来自已建立的人和鼠的胚胎干细胞。
" P( O8 B/ j. U
" ]- v4 \& M6 { j/ S大多数的核心多潜能因子一旦外源性表达，他们可能形成某种自身或其他多能因子的正反馈以及feed-forward 环路，以维持外源性因子表达消失后
8 ~; a5 V/ @- e的多能性。
6 Q/ |! |! z9 o6 F. H4 H9 A& }! w6 s# h0 u
而转录因子错误地binding targets可能是另一个许多细胞无法获得多能性的原因。( P8 b+ R" R* ^6 b
$ E$ Z) J* S W+ m
不同的路径导致相同的多潜能原始状态（ground state），还是不同的转录因子通过合成的互相促进激活了同一条重编程机制。2 e, a7 B: M: l
3 Q: D$ g% f( c% Z+ c7 [ z拮抗因子与合作因子$ [4 r4 S$ x1 K% I3 q* O" P
! K# Z9 O( j# x4 Q8 v, r: r% {+ ]iPSC的形成速率低于核移植和细胞融合，提示还有其他与经典四因子协同作用的因素，这些重编程的调节因素（modulators）可以归为几类：转录
/ r* p5 h: w5 N! B4 W因子，miRNAs，染色质调节因子，生长因子，以及以上述因子为靶点的化学小分子，p53作为细胞凋亡因子，TGF beta拮抗提升重编程效率和速率，! S+ {, d3 ^ \2 g, J& d
以c-Myc作为一个下游效应器的Wnt signaling通路，还有操控表观遗传调节或修饰因子的相关因素和通路，如染色质修饰因素以及一些miRNA等。
5 \8 i* f- K5 k2 ?+ E* ^% h
$ d5 S: @9 t" a: |9 W% h5 K% b重编程因子与其他类型的多潜能状态' m( H. M: s9 t& X6 ]
9 X# Y! {) j. O2 j1 h. O/ A
人的胚胎干细胞和iPSC更接近EpiSCs而不是ESCs，提示所用的培养条件获得的是某种primed而不是naive的多能状态。 5 A4 f" {. w# p
0 \8 c" t( D) D& G4 g, s! b" }
iPSC与胚胎干细胞的对等性问题，以及成瘤过程与重编程过程的惊人相似问题。
% O9 ]* n" g& h3 B. [3 u O/ A2 U4 e
3 J6 {8 L6 P ]- O z7 w$ n
VII。Pluripotency and Cellular Reprogramming: Facts, Hypotheses, Unresolved Issues
0 S- G7 y/ e: _' t! p+ d; K$ X' R
! N# J1 C6 i: O4 }. mJacob H. Hanna,Krishanu Saha,and Rudolf Jaenisch，Cell 143, November 12, 2010
) m6 f2 A# z1 v" g
% T E N" W3 k8 S: v, t4 h% j* }; xYaenisch这篇关于多潜能和细胞重编程的“前沿评述”文章体例与以前的传统综述有些不同。广义的干细胞与重编程研究进展，在不同干细胞多潜能
& \: @+ j8 |9 o, n5 [6 L( P状态之间找到越来越多的相互关联，直接的或间接的。从多潜能这个核心性质来看，可以把目前已知的不同种类的多潜能干细胞串起来考虑。直接重
% x9 `, v1 z' L' b编程也越来越呈现为一个动态的、多性质的过程（相对一个静止的、均一性的状态）。这对宏观理解重编程及其在干细胞研究中的关联和地位是必然4 z' M4 d0 H5 H5 E
的趋势。因此，文章题目为“多潜能与细胞重编程：事实、假说与未解的问题”。着重于讨论不同的多潜能性和分化状态的细胞之间相互转换的调控
, c' s; H Q7 H7 S# B机制，及其相关新概念和未解的问题的提出。0 t7 r9 R* r- R% z! c9 r. q( E
: a$ _, _' s% ]* e1 {该文首先概述了从发育角度获得的各种多能性干细胞，即ESC、EpiSC、EGC和maGSC，从分子水平界定这些不同多能状态的定义，讨论了这些不同状# i& V* v' h$ P, |, D# V
态的“稳定性”及其相互转换情况。随后在这个框架上讨论了人胚胎干细胞的多能性。这个框架为体细胞直接重编程为多能性状态提供了一个基于多
6 l' E8 b% X' Q潜能状态的比较背景。直接重编程的最突出特点是其动态化过程以及多样性状态（dynamics and Heterogeneity）。多样性可以从iPSC的低效率来看，) C/ D5 N; y0 g$ b/ l: ]1 G2 I
也就是说只有一小部分细胞通过重编程获得多潜能。虽然现有的证据基本证明终极分化的体细胞确实可以重编程为多潜能状态，而且这个重编程过程
/ P) g w% h0 p并不“青睐”分化程度相对低的细胞，但来源细胞的多样性还可以体现在不同的“永生潜能”，衰老，以及对外源性因子表达的耐受性（凋亡）等。
" y' B/ }- P& P( }2 q而且，多潜能标记物如SSEA1等的表达是“非特异性”的，也就是说表达这些标记物的细胞中仅有一小部分最终达到iPSC阶段。此外，某些iPSC clones
+ w/ c& w+ ^& ~有可能是别的clones的“姐妹克隆”（sister clones)，这种可能性仍未得到认真的探讨。
/ m, U, ?- N; R2 S. H1 h/ L; s" E$ N- Y
此外，采用病毒转染也呈现出大范围的基因表达水平不一。还有证据表明细胞分裂周期及其伴随的DNA复制过程，表现出差异性并影响重编程的进程。/ ~$ J3 @% Z h5 O: m/ ^
DNA复制过程的表观遗传修饰对外源性因子的binding起着重要的作用，而且激活内源性自调适多能基因表达以维持多潜能状态。有多少这些表观遗传
% T: B2 H+ a$ x* n4 g5 I6 K的修饰起着重编程限制作用，以及每一个表观遗传因素的限制作用有多大，仍不清楚。当然，heterogeneity的情况还包括iPSC诱导过程的一些中间阶
% j$ A4 ]$ @0 u: L0 B2 m段。! j4 D+ o6 h0 j a- D% G6 ?
, O( n/ T+ T) \: [& q& g
从上述iPSC诱导过程的动态性以及多样性角度来看，多潜能状态从特定细胞谱系的单一潜能到类胚胎干的多潜能状态，可以描述为一个一定比例的细; ]% K# S. V# A+ U0 S8 n( v, f
胞在特定的培养环境下，经历一定的时间过程改变细胞状态的模型。这一模型可以用数学手段根据生物学实验数据来模拟，这是系统生物学的方法。4 I5 q/ L5 m# a* [
已经有一些相关的模型，其中一些可以有效整合现有分子生物学模型所无法考虑的动态因素，结合已有的实验数据，这类模型对未来细胞状态转换研) d5 G% {* M6 m9 {) ?9 b
究有着特殊的指导意义。本文简介了其中的一个模型，该模型的内容详见下面的XVI专文介绍（Reprogramming cell fates: reconciling rarity with
- m/ D) U& k) g. G4 Mrobustness），这里不予多叙。6 a9 p# r8 Y- R! e% J$ b
; W8 Y1 _ o2 a) q
关于直接转分化现象，该文认为仍需要更深层的证据来证实不同细胞系之间的转换有完整彻底的基因表达转变。换言之，Yaenisch认为直接转分化还+ _6 |/ Y1 G) c3 u& l
不足以放在上述重编程框架中来详细分析。" t4 z* ]# H5 B
+ B0 r9 o' _" V: @- y; c! i2 _( v3 ^
, \8 j( c6 K( o3 o2 C. T0 R6 o
VIII。Open chromatin in pluripotency and reprogramming
3 z* T3 a% A- o% f, `# f8 W" _6 l
' s5 h* [! M0 m6 r6 ^! lAlexandre Gaspar-Maia, Adi Alajem, Eran Meshorer and Miguel Ramalho-Santos
$ A7 Y+ P7 v* b: f; b
4 y5 T, F6 y9 p% s, FJANUARY 2011 VOLUME 12 Nature Review Molecular Cell Biology
- c4 F" d! {" D4 l' h" s( ?+ D2 l- y
+ s, i- ` G% z9 r3 c! A2 X( N这篇文章专门讨论染色质的开放程度及其与干细胞多能性的维持的关系，从而引伸到诱导重编程过程的染色质状态。研究已经证实，发育阶段的早期- V8 a3 ?1 H, s I) G1 G* i3 R
囊胚细胞具有开放的染色质特性，而从内胚层获得的胚胎干细胞也具有类似的开放染色质特点。开放的染色质，无论是特定基因还是全局染色质结构，$ q$ b+ Z& w0 g& N- c' v
利于维持多能性的因素如转录因子的binding。而随着发育过程，细胞分化，开放的染色质逐渐让位于非开放性染色质状态，比如heterochromatin，从
6 M* H1 r: }( t而阻止了多潜能因子的结合。而在细胞重编程过程中，成熟细胞的非开放性染色质状态被重新修正为开放的状态，从而使得多潜能因子可以发挥作用。
0 u3 T4 {3 d5 y/ x5 B9 G总体而言，与成体细胞相比，胚胎干细胞的染色质处于一种全局性非压缩状态，其基因谱中抑制性hetorochromatin的比例远低于成体细胞。 f! m) {! R4 Z/ ? a: E5 q
7 _& y3 C: c: n" e3 X [
多能性的维持所需要的“开放”染色质状态包括两个两个原则：特定的因子维持全局性开放的染色质状态以便转录激活；专门的染色质调控因子参与$ o: j% a" [2 m3 u3 `5 }/ X6 P: g; O, p
局部的细胞谱系基因的沉默，直至分化开始。同样的双价原理可能适用于多潜能性重编程以及癌症去分化过程中“开放”染色质状态的重新获得。1 Y6 Q2 m% \$ _
' o# Y) S$ R: h+ r, O
多潜能干细胞中参与染色质重塑的蛋白可被分为四个家族：SWI/SNF (switch/sucrose nonfermentable)，CHD (chromodomain helicase DNA-binding), M$ g* {8 l# m
ISWI (imitation switch) 以及 INO80 (inositol-requiring 80)./ t4 N+ y1 D" w8 Z# s/ l
& E# r, y3 h9 G/ c$ q3 |! l' u
开放性染色质的维持，除受到富集的主动组蛋白标记影响外，还可能由 ATP依赖的染色质重塑酶的主动性维持，如通过解构nucleosome，以及“拆散”8 R Y j" _0 P6 S- X. U( O% Y: L
更高层次的染色质结构。! f# J; ^/ V% ]) _( H
% a2 M6 p# C! }. i
重编程过程中，细胞染色质的结构发生了很大变化，如DNA甲基化，组蛋白修饰以及nucleosome spacing。这一层的表观遗传调控在体细胞的作用为抑
$ G H! r- l9 u+ H/ f" Y) L7 }- H制性机制，以防止其他细胞系的非预期的基因表达。这些表观遗传障碍在重编程过程中是如何被克服的，是重编程机制的关键问题。, c. J% [9 H7 f2 k! s, g; B
$ f' F. I& `; [- ~1 B; x9 A
有研究显示，诱导重编程的iPSC具有某种来源细胞的转录记忆，提示上述体细胞向多能细胞的重编程过程涉及重塑染色质结构。' T3 G4 Y$ O! A# x5 w5 b
: p) H3 b- L; N1 q5 v) K) _7 K
而在癌细胞非分化状态染色质同样具有类似的开放状态。在高层染色质结构上，某些恶性癌细胞如乳腺癌和淋巴癌丧失了heterochromatin状态。( m- T1 x8 n0 m/ V5 Z2 u
) z( \! Y: I: v$ E对多能性的认识的一个重大缺陷，是不同层次的染色质表观遗传调控机制是如何相互作用的，以及是如何与转录网络机制相互作用的。显然，更多的注2 W* `& s* A( W j, u t. \) d9 c
意力应该放在整合多能干细胞各个层次表观遗传调控机制上，例如genetic epistasis分析，以及蛋白-蛋白相互作用，并解析这些生物信息如何在分化过
" U1 N1 j. Q; B9 F9 S& I: v# H程中be parsed ut。
% }6 I* d5 Q' y& X; l) I: K! t8 H( D' M3 d8 Q
7 l5 ^( A0 q/ w5 @2 kVIIII。Dedifferentiation, transdifferentiation and reprogramming: three routes to regeneration
7 n( h0 t& B9 W' _6 p" {7 ?; }; K+ Q/ x" Y) _: x" R
Chris Jopling, Stephanie Boue and Juan Carlos Izpisua Belmonte
8 H/ C6 |3 b% T) E& Q) h( FNature RevIews Molecular cell Biology Volume 12 February 2011' c+ o# x& [* W2 j
6 @, ?% P/ K C9 R+ t3 w这篇文章将生物界自然发生的去分化（dedifferentiation）、转分化（transdifferentiation）以及各种体外实验重编程放在一个比较的框架中加以讨论。$ i- Z$ ^$ e5 m, V
一些脊椎动物具有完善的器官再生能力，这是通过自然的去分化而达成的，如斑马鱼的心脏再生、有尾目两栖动物的肢体再生以及哺乳动物的神经鞘细1 L' `+ I2 r E8 K
胞等。去分化过程中，分化细胞退回到一个本细胞谱系内相对的弱分化阶段，然后经过增殖，再分化为同类的成熟细胞。实验手段可以在体外诱导类似
5 Q, G. r: ^9 b, X' ]的去分化过程，如肌肉增生以及诱导心肌细胞去分化再生的努力。转分化比去分化更进一步，分化细胞“退”分化到一个更原始的状态，然后激活自然# }* g# x3 ~3 v; m
发育程序，使得它们可以跨越细胞谱系而分化为另一种细胞类型，如蝾螈水晶体的再生。虽然转分化一般涉及去分化和增殖再分化过程，但也有可能通/ O0 j& [3 p: q: K) a
过同时下调一个机制并上调另一个机制而达成，这个转分化现象可以通过实验手段来获得。例如，CEBP alfa和beta可以同步下调B细胞特异基因以及上
% O/ O- d0 E, E/ ?4 @# ~* F; I调巨噬细胞基因，从而把前者转分化为后者。这个过程涉及一个“非自然存在”的中间状态，在这个中间状态两种细胞的基因表达均比较低。另一个例% F) c1 a0 L" E N+ S5 H) P
子是beta肝细胞转分化为beta细胞，以及胰腺外分泌细胞转分化为beta细胞。这个例子的一种可能机制是经历一个去分化然后再通过发育机制再分化，" J8 e! {1 _# ~% L. ]
另一个可能的机制则是类似B细胞转化为巨噬细胞的非自然中间阶段。其他的转分化例子还包括成纤维细胞转分化为神经细胞、心肌细胞等。
, f' Y5 N" Z! }/ `
$ F5 a5 k t+ w4 {0 i: O重编程（reprogramming）则是将分化细胞一路退回到完全的未分化状态，从而可以再分化为任何可能的细胞。从机制上讲，三种主要的因子Oct4、
3 T% P* w4 A5 Z' v9 U1 p5 S4 ]Sox2和Nanog都可以在不同的水平上发挥作用，如直接激活或抑制转录过成，并且可以通过调节表观遗传修饰因子和miRNA来控制基因表达和细胞周期5 {# Z( l3 u- P/ w1 |
同时，这些转录因子还具有自调节作用，形成一个“正前馈”调控机制。此外，Oct4和Sox2还可以调节Nanog的表达。这些转录因子可以激活一系列多能
& U3 D8 g$ `" U6 S5 m性基因，并抑制许多分化有关的基因。重编程表现为一个非常随机的现象，如特定细胞群中的不同细胞可能需要不同的时间来获得多能性，这个期间发生2 @( u! e& R' D9 a
的“事件”包括细胞周期的变化及其带来的表观遗传修饰和基因表达变化，从而使得细胞对重编程因子的反应增强。这个机制可能涉及染色质的开放以及+ c9 x3 y; L; c: e% M: U. Z9 \$ Y ?
维持分化状态的基因表达的抑制。这些初始的事件可以被看作是一个使得细胞处于一种“待发”（primed）状态的过程。
4 F/ f; c7 }# I. a: ?$ p9 o* A S; Z$ S1 H* `
待发状态的细胞并不直接进入多能状态，而是要经历一系列的重编程事件，如表观遗传修饰，分化基因抑制，干细胞基因激活等。问题是这些事件是完全
- J- v# U7 l; Q U8 m( t+ U随机发生的，还是遵循一个特定的因果序列。实验证据发现重编程过程似乎经历某种“中间状态或部分重编程状态”（intermediate or partially ! [- x( d6 _7 f6 P9 \: N; E
reprogrammed cells），这些证据支持特定因果事件序列的假说。最后的阶段是完全的多潜能的获得，这一阶段要求关闭外源性基因并激活内源性多潜能
y3 b* p' v9 ^机制，Nanog似乎在这一阶段起关键作用。细胞系特异基因的完全彻底关闭也是关键的步骤。这一过程涉及组蛋白和DNA甲基化。6 ?3 h& r: J; E! h; c
0 `) ]! O7 t7 J! G0 ~( {
上述三个过程都涉及将高度分化的细胞变得更具有可塑性，问题是重编程是否可以借鉴去分化和转分化机制的一些经验。去分化与重编程的相似之处在于- |3 a( t$ f9 `/ m$ a
两者都涉及分化细胞的“退”分化，甚至可以把重编程看作是去分化的终极形式。这里的一个问题是是否需要一个细胞分化状态的“解除”从而进入细胞
1 P0 }8 y, d7 J8 R0 W) U周期，从而开始去分化过程。这两者的一个主要差异是去分化涉及一个逆转自然发育分化的中间状态，而人们还未能在重编程中发现类似的自然发育逆转
& M, n7 y% ~6 h1 s0 S3 _中间状态。
* \8 y! Z. c" l$ h' Y, S/ {! r( ]7 K4 b. ^/ E
去分化和转分化也有一些类似的地方，比如一些转分化模式也涉及去分化过程。转分化与重编程相比较，转分化过程是一个同时下调某个机制并上调另外
+ g! m) \- R( Y1 g& f1 m一个机制的过程，从而导致某种“非自然”的细胞状态。虽然实验性转分化似乎也可以导致某种中间状态，在这个状态下细胞系特异基因和多能基因都有! n9 O3 J. k# S: I: G5 {
表达，但这个状态是不稳定的，可能是由某些机制的“残留”所致，如基因表达后的蛋白或mRNA残存。转分化的最终结果是另一种分化细胞，而重编程
, a2 h% q a! ?5 x* [则是多能细胞，因此这两者是否具有某些共同的机制，还很难说。1 ?" [2 L5 U& r0 p: o# x+ t
! V( v$ {& {6 |! k$ `上述比较的一个要点是这三种途径的“自然性”，即去分化和转分化都可以自然存在于生物体内，而重编程似乎还是一个完全的人为体外非自然现象。在
* f7 i3 U4 {# r- |这种情况下，设法借鉴自然的去分化和转分化机制使得重编程更符合自然过程，是有意义的思路。例如，设法模仿自然去分化的初始事件，选取具有确定& L& J: r( g p* b. T B& u T* }
的细胞谱系去分化潜能作为靶细胞，而且某些转分化因素同时具有诱导细胞去分化的作用，这一点可以在设计重编程策略时加以考虑。从应用来说，iPSC+ t5 T) n4 |& E8 S9 ^
重编程的安全性是第一位的考虑，因此转分化策略似乎具有更少的风险。
8 y, _( e& V9 w& y7 P7 l9 _8 a+ d7 N, q0 q9 V
6 E F9 p- Q& L' u( J; O
X。Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape3 E9 c2 o8 j* l3 j) O7 Z
2 u; D g' g) e# zBernadett Papp1, Kathrin Plath- j) F5 y' X! Y. D; O
Cell Research (2011) 21:486-501. published online 15 February 2011
& k; Y ?# I/ P, |& _* [1 S) k$ E$ s6 ]: G& z1 f
如标题所示，此文着重重编程的两个问题：表观遗传及其循序“复位”（到多潜能状态）。表观遗传在重编程过程中作为主要的“路障”已经得到很多研
2 K9 \5 D A( u+ o: F7 H, {究结果不同角度的确认，分化细胞的特定表观遗传状态如何逐步放松，转变，直至“回到”多潜能的“开放”状态，构成了重编程的核心系列事件之一。
5 k. d* M+ v& J如上述一些文章所说，这个转变过程是否是一个有序的过程，是否一种“逆发育”的过程，还是一个随机过程，这是个仍未解的问题。因此，这里的sepwise
! o) E b" [# t0 ^& Qresetting有某种“循序渐进（退）”的意味，可以看作是一种试图找出有规律的连续步骤的努力。" |' Z0 _& H" u1 C' E
" N0 p5 s# [) g8 w, z% i- o
该文对iPSC诱导过程所面对的主要课题也有基本的描述，包括低效率慢速的问题及其可能的原因，iPS与ES是否对等的问题，来源细胞的表观遗传记忆问题
: d! B5 u; Z" {8 R- i& Y9 m等。引用iPSC诱导过程的现场imaging研究证据，作者提出iPSC重编程过程遵循一个协调的渐进步骤，包括引发分化细胞特点改变的初始事件、以某些ES标6 S5 Q( G8 Y" ^
记上调为特点的“前多潜能状态”的获得，随后达到包括所有关键多能基因自我维持表达的多潜能状态。在讨论了这些阶段所包含的各种主要事件后，作
? v3 k* j( v5 ?. B者列出了一个与发育过程相对应的“逆发育”重编程主要阶段以及各个阶段的主要事件表（为保持技术性含义的原汁原味，具体事件的描述保留英文原文）：5 a( P5 I; d! }
( Y4 m( O6 N c
——重编程因子表达：Oct4，Sox2，Klf4，C-Myc
. i, W& l" m* }1 @: v4 e
1 [+ `8 k1 C& ?# I——早期中间状态（Thy-，Snail-，E-cadherin）
5 K' g8 P# a2 s8 W) u3 @ －mesenchymal-epithelial transition(EMT)5 Z7 G; I$ s4 X
/ f' H. p1 c1 b——后期中间状态（pre-iPSC）
, ?; ?2 G1 X) t b －Intermediate transcriptome-epigenome-DNA replicaton-cell cycle3 T+ G' l9 I( d) c
－late replicating inactive X is retained in femels+ x+ L6 F2 @9 z; ^2 k4 i8 d
－lack of replication timing shift from late to early of regions replicating early in ES/iPS cells
- [6 W/ q; z7 F' s6 i6 ^6 Q. [ －pluripotency genes not expressed but somatic program efficiently donregulated: E9 {/ k2 {' _8 E/ ` M" n
－reprogramming factors not engaged as key pluripotency targets% \8 N! t: j! \, ]
－reprogramming factor-dependent: \' X) O* |. |- G
' f. j* N' z- ]) A e1 w& _! _
——早期iPSC状态
. |$ V4 q# Q, }* V9 R' z- N- h/ { －Global Genome Reorganization based on characterization of replication timing
1 G+ W+ w/ ~( S7 L! k, W4 f* p) | －ES-like transcriptome-epigenome-DNA replication-cell cycle& M0 g) t! l& Z8 H6 M) S
－X chromosome reactivation in females
% u! x) Y+ x. }5 d1 ]3 f" n －upregulation of pluripotency genes7 _9 C8 O7 R; y: q7 Q- C
－gain of naive pluripotency capabilities
* @3 E4 v6 m8 H0 ]8 F* l# j+ [5 E7 W5 {! Y0 _
——iPS cells) j5 O7 C5 u. A
－erasure of epigenetic memory
3 ?0 q) [5 R0 A# z) v- o
9 [: Q9 l0 x% t& W把这个过程倒过来，就构成一个与发育分化过程相对应的逆反路径，发育过程也由可以描述为几个主要的阶段如ESCs-EpiSCs-Early lineages，各阶段具有相
2 v9 L3 A2 q, y/ c7 c应的主要事件。: i; G c2 e# l6 k3 w6 `
. M* G' E t* S* r
从实用的角度而言，iPSC重编程机制的研究不仅可以提升iPSC诱导的效率和效用，同时可能有助于理解并更有效地设计绕过多能状态而直接转分化的技术。+ c9 K" c0 q7 O+ d8 D8 k7 a) M' z& I
例如，某些直接转分化过程似乎不经过iPSC过程的最初细胞分裂。如果上述把诱导多潜能重编程看作一个“逆发育”过程，那么直接转分化是否或者在多大$ w/ O' o, S! _" ]0 _ e. Y9 Q+ M( Q
程度上是一种“部分”逆发育过程，值得研究。而要研究这个问题，有一个逆发育的参照系是必须的，也许上述iPSC的“逆发育”过程可以作为借鉴。) {% ?6 l* n r2 P
. p3 Y8 R7 y2 e2 o8 d! t4 M& ~
2 a' m* D, [4 W% R" Q. s- b) XXI。Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state
F o4 |. h0 Z9 b0 \' k& y
0 x- u3 E1 g# x( N3 XKathrin Plath and William E. Lowry
# ]% f; }- h" ^/ U ]NATURE REVIEWS GENETICS VOLUME 12 APRIL 2011
, l! z# L+ K3 z! A) g
6 y& t' A( J P2 ~/ J这篇综述的作者之一Kathrin Plath也是上一篇的作者之一（她又是曾与Hochedlinger联合发表过综述文章的），相隔两个月发表在不同的杂志上。因此本
" }% E1 o, ^/ z& r. k7 i文关于iPSC研究现状的总结和分析内容上有比较大的重叠。本文的特点之一是比较突出了iPSC研究的新技术进展，从技术角度展望未来的研究图景。
. B% e6 r+ F* z; I$ C7 c9 f/ S. \+ A8 B, D7 I
检测iPSC重编程整个过程目前仍无法做到。例如，目前只能通过多潜能网络的表达来确定真实的重编程确实发生。因此，目前几乎没有办法确认哪些早
/ @2 Z. Q1 F! f6 F( Z# R期的分子事件发生在那些命定要经过重编程的细胞，而哪些分子事件发生在哪些在重编程过程中被淘汰的细胞。要解决这个难题，或者我们需要找出一4 M$ c: c0 X* F' W5 {" [! w7 E
种极其高校的重编程技术，从而提供足够的条件来甄别具体的分子事件；或者设计一套早期表观遗传标记方法，来选择那些可能走向完全多潜能的细胞。) v: i* r" o3 h, f( V4 T) Z
同样，可诱发的（inducible）重编程因子表达系统以及单细胞技术，需要与全局基因谱系技术有效结合，如转录谱分析，染色质免疫沉淀反应结合高通
: t' [: c, {- C5 ~3 x1 Y量测序（ChIP–seq）技术。目前整合这些技术用于重编程研究，如果说并非完全不可能，至少是非常难的。 ?1 {. u0 j0 q1 z5 L
$ ?# `% F1 \" m$ f
简而言之，单细胞分析结合高清晰度时间分辨率技术是解析iPSC重编程机制的终极条件，在达到这个技术能力之前，只能依赖于操纵那些或驱动或妨碍9 B& y$ K( J" |
重编程过程的转录过程或表观遗传事件的结果，来推断重编程的具体机制。' N, F. H/ s6 I% n0 C' T& O5 `1 I" U
* W3 y2 q. @9 ^+ X4 t; Z; @+ o/ S2 l! V
% W: w/ N4 Q1 c$ o' V# g$ p+ LXII。Reprogramming: What’s Unknown?
, h! C4 j) d# j* q2 b6 P$ d7 j- c: P6 z- E/ i0 B# P
George Daley，Azim Surani，Elly Tanaka，Kathrin Plath+ y- Q9 U1 K5 f
Cell 145, June 10, 2011
% {( }( _- i' ^6 a
* m+ K1 ^! @+ O2 ^+ s1 u+ M2011年6月刊的Cell，基本上是干细胞专刊，有一些重量级人物的观点、述评及综述文章。其中在“前沿观点”栏目，四位专家就重编程研究发表了他们
1 z% i& |1 H: N, C各自关注的一些问题及看法，基本上属于启发式的观点。综合摘译如下：
3 Y% N5 j1 S5 u% x5 \
* Z1 N7 A# e t% l7 @' ~5 TGeorge Daley： }" }, |- e/ L, w7 _( P
3 F. E1 n, j: y9 g8 _3 n5 G
什么样的分子水平互动触发了重编程？1 U" x' Z6 t9 a N
其精确的连环过程是怎样的？
p: Y, m7 ?7 R; P, V) e1 l$ e 哪些是随机的那些是“命定”的？2 ~" x# l9 U3 M% w+ L) o0 s4 a' p
哪些步骤涉及细胞分裂？' P1 C; j4 |- O$ S, w" S
所有的细胞都遵循同样的途径跨国Waddingtong landscape，还是有不同的道路、中间状态、以及死胡同？# W$ J* z/ {, @: p
重编程能否模拟反映体内病理性去分化？
, P8 D& ^; T8 t6 N9 v 去甲基化是主动还是被动过程？& S" H+ q) X: `1 T* Z! b5 ]3 |( K* m
5hmC在重编程中起什么作用？5 n+ Q: M( j; n4 w
卵泡浆是否存在促进因子诱导的重编程的因素？
5 n( L; S! N$ W( [# L7 v; l( @ 进一步的挑战性问题包括：能否制造不存在于自然发育和并且不受正常生理过程限制的新型细胞状态，例如分泌胰岛素的肝细胞或病理归巢于心梗组4 y& K* J; @$ W! s5 ?9 v! y
织转变为心肌细胞？5 v: W: M* n/ Q! ]
甚至，重编程技术有一天会制造出一个全能的杂合子？
4 G+ _: Y& ^0 z3 \* B" }& T% ?2 M7 n1 c! F+ S
Azim Surani2 s/ d+ v7 G8 F% W+ h
- D8 s: z+ e9 d- \" @& z4 X2 V$ K 频繁的重编程也发生在体内，特别是生殖细胞全能性的获得过程，而且这个现象可以在体外复制。尽管已经掌握了大量转录因子、表观遗传修饰因素8 g4 A; b( m8 O/ t3 l
以及非编码RNA在重编程过程中的作用，体细胞重编程仍是一个非常低效率的现象。或许深入了解生殖细胞的重编程机制有助于提高体细胞重编程的效能。
% f: c! }4 n( I" n 此外，急需建立某种综合性的，有条理的认知理念，有效概括各种重编程相关条件和因素及其在不同系统中的作用。体外体内相关信息的整合可以有% u& _+ O- s1 {( B1 h. S+ f
助于改变目前重编程的随机性，而获得某种确定性机制。$ A% s% K4 w$ K8 x: L' \
而卵移植后的细胞核重编程以及体细胞－干细胞融合后的杂合体机制研究，也可能为初露头角的实验性转分化打下基础。
. o6 v6 w# M) k( D3 r: W( b2 g# e0 v+ [
Elly Tannaka8 S' k% W) V) l# v4 q1 k
6 a( I6 L) T, Z; i1 S5 b. ]2 h
重编程的分子机制之“门”？foot in the door
! e" j/ A# k. S% D [. ^ 再生过程中，前体细胞可以获得某种胚胎-成体杂合状态，即某种新的细胞形态，或者是某种部分重编程状态。理论上，这个现象涉及基因调控网络的6 M8 x- S# ^+ p, u
新式组合并在一定的时间共存。这些新组合是如何达成的？
! c$ _: t2 f1 S, f/ p2 m 为达成这种杂合状态，控制基因调控的表观遗传机制在多深层次上需要被解除？1 N& P: A P, U' G+ W- n+ P
能否制造出有（生理）意义的细胞杂合状态，诱导分化时它们又是如何解除这种状态的？
4 c9 T. m' z$ G" A1 X 目前的胚胎--成体杂合细胞状态还仅存在于特定细胞谱系内，能否制造出有价值的跨谱系杂合状态，或者这将完全违背基本的生物学禁律？! C1 M9 T4 Z+ V' V
( ?* l8 f7 x2 ~8 Q6 V; mKathrin Plath, Q8 I8 P1 ~ G" \5 q: ^& m4 ]
: H' w# Y/ ~5 j) v% x 分化细胞的特征是通过表观遗传机制加以稳固控制的，尤其是那些未表达基因的heterochromatinization。重编程过程中，这些抑制性染色质状态阻止; }. k, L& i* s! K& q
重编程因子的结合从而不能无法激活多潜能基因。目前仍不清楚重编程因子是如何获得结合的，为何结合只发生在极少数情况下。这种罕见事件可能是上调
+ C7 n; i5 n/ h+ O6 [9 o! p或者下调某种染色质调控因素，从而减弱抑制性表观遗传机制。1 [: w& m0 y! b% Z& U- H
而且，早期发育过程伴随有细胞核结构、DNA复制调控、以及染色质全局构造的重大变化，而且这类基因层面的重组是发生在胚层分化之前的。因此，8 p5 w" P8 w* u+ b' E j
有可能难以逆转（revert）这些基因层面的全局性改变，构成了重编程过程中多能基因激活和完全重编程的主要障碍。
# s2 R" F# F. y& g
n5 I: ?3 n! A# I6 y% x7 O: D; t$ i* h- [' n- L9 ]" }! e
XIII。Chromatin Connections to Pluripotency and Cellular Reprogramming( V* Q" V) H T1 w) ]* z
8 L4 S' Y( A$ d1 IStuart H. Orkin1 and Konrad Hochedlinger ; ?5 o t/ ^) A1 d* v4 \6 E
Cell 145, June 10, 2011; d- _5 Q% D* f
' x; Z5 Z2 w( N& Z L- x这是一篇典型Hochedlinger风格（style）的综述文章。如题，染色质状态被作为多潜能以及细胞重编程的核心事件，这种核心作用可以通过X 染色体灭活、
: h' t% n$ v9 D5 W非编码RNAs调控以及（培养）环境因素对细胞状态的影响来表示。通过分析胚胎干细胞多潜能状态的维持机制，胚胎干细胞的独特开放式染色质结构，胚胎
. n* X* _+ O6 {% t+ w干细胞染色质结构调控的对立系统（permissive vs. repressive）研究的梳理和分析，阐述了胚胎干细胞为多潜能模型中，染色质状态与多潜能调控因素之间6 }& \: ~/ y& p! {
的互动关系。
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然后，以 X inactivation为模型，概述了多潜能因子与染色质结构之间的对应关系，以及这种关系在胚胎干多潜能维持和细胞重编程过程中的意义。其次，整
. C4 ~, [) V4 I0 |& v/ Y理了非编码RNAs调控染色质状态和多潜能性中的研究结果。随后，将培养条件作为“环境因素”，讨论了各种环境因素在维持不同干细胞多潜能状态及其连+ } {$ w4 j& {3 g' m
带的染色质结构上的意义。
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从胚胎干的多能性维持到iPS重编程，最新的细胞重编程现象是细胞系之间的直接转分化（transdiferentiation）。即转录因子过表达诱导的多潜能状态细胞，' d7 n' i. g- ~
在合适的培养条件下，可能转化为另外的细胞类型和状态，（这里说的应该是iPSC方法的改良，以通过一过性多能性诱导，然后直接在相应培养条件下诱导+ P! |- v. I" z+ Z& u+ g' ^/ K
为特定分化细胞。可以命名为“诱导多潜能直接转分化”这与直接用目标细胞特异性因子诱导细胞改变表型的直接转分化还是有不同的。不过，后者的机制
; [" j, _5 n; L' C仍不明确，是否也经过了某中一过性多能状态仍不清楚）。Hochedlinger根据现有的“诱导多潜能直接转分化”结果，提出了一个成纤维细胞由多潜能因子( ^/ C+ C9 l+ k* \5 m- l2 ^
诱导为某种“可塑性”的中间状态，然后在不同培养条件下可诱导为iPSC、EpiSC、神经前体细胞、血液前体细胞以及心肌样细胞的模型。这个模型借鉴了丁9 v7 U6 z# R' P. l
盛等提出的“fall back”模式。从发育潜能上来看，从iPSC到心肌细胞，多潜能性逐渐减弱。各种“结局”所需要的培养条件是不同的。这里的关键是所谓
2 q! o+ s) H Z' l) s# x% \“可塑性”中间状态的内涵：包括染色质结构放松，某些多能因子的激活，某些目标细胞系基因的激活，某种分化可塑性。这意味着这个中间状态其实是一
3 S. Y7 b- Y( {' I* V. C) O个“非自然”的杂合状态，即染色质状态并不是完全关闭的（如成熟分化细胞的染色质状态），也非完全开放的（如胚胎干或iPSC染色质状态）；既有多潜1 r- {: L& k# w" U
能基因的激活，也有细胞系特异基因的激活；既可以是一种相对可塑的多潜能状态，也具有分化的潜能。用时髦的术语来说，是某种“待发”（poised）状
4 t" A6 P0 o/ D( M4 V- j. G态。4 G, k5 P4 c1 @# r: }' f, T; e
- T5 v# L# l) c- J( z+ [0 M关于直接转分化的可能机制。一种可能性是过表达的多潜能转录因子与细胞系特异性靶基因的异常（非生理意义）结合，从而诱发了相应的细胞分化通路。
4 p6 L; ]$ x; F* [. q部分重编程的iPSC具有某些异常的基因表达，以及多能因子与分化特异性基因的结合现象。而且，OCT4过表达的成纤维细胞表现出OCT4与血液干细胞靶基
' e' Y" w% w* U: M4 L; q- f, {因的异常结合。另一种可能的机制是多潜能因子本身正常情况下也才与胚胎细胞的早期细胞系commitment。确实，目前关于多能性因子的研究证实，多潜
4 E$ {0 {$ f E! ?- L8 z9 D能因子可以作为某种“先驱因子”(pioneer factors)，在胚胎细胞受抑制的（分化）基因中建立某种转录潜能，以利于分化特异性因子进一步发挥作用。还有0 Q( E2 H1 f, `
一种可能性，多潜能因子本身可在早期胚胎发育过程中直接激活细胞系靶因子的转录。如Nanog在内胚层形成中的作用，Oct4在中胚层分化及其随后的心脏) R& J% c! ]6 K: r) B4 B
与血液细胞系统分化中的关键作用。
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无论上述转分化的机制如何，多潜能因子似乎可以作为某种主动的细胞系分化决定因素这一点，使得我们有可能跟据现有的转录因子binding数据，预测特定
$ O$ n% Z9 h9 u* B7 R" @8 C多能因子的过表达可以导致何种细胞系分化。此外，更深入的理解不同的生长因子通路与染色质状态的关系，将会有助于理解正常发育机制，并提供有效手/ p% u8 x. b- L- L
段通过操纵特定的蛋白来转变细胞的类型。) R1 f+ `: a8 l5 o1 r
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XIIII。Cell Fate Plug and Play: Direct Reprogramming and Induced Pluripotency
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; ]( r+ W, X! dStuart M. Chambers and Lorenz Studer
& G; C! C9 p$ |& O3 o# R; SCell 145, June 10, 2011( ]$ t. h- c* P( U8 N
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这篇“短评”概述了最近关于直接转分化的几个重要结果，即成纤维细胞转化为神经元、心肌细胞和血液细胞的结果，提出了一个直接转分化研究的路线图，- j: @& f' J* P" b6 P
包括六个步骤：. S) ?8 A+ P5 C! S$ }" l
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（1）确定可重编程的来源细胞（克隆培养条件）
, w" h' u6 }) s （2）界定重编程因子的最低限度组合（一一排除法）4 F2 D; |! y0 X, x# }/ J9 p
（3）监测诱导效率（重编程细胞的比例，修正增殖作用）
# P2 ]" M* s$ S) X, k3 T) Y （4）比较诱导细胞与靶细胞的分子水平标志（转录谱，表观遗传，蛋白质组）' }8 \8 e5 l) X6 q$ l- V1 M+ ?' m' I
（5）监测体外体内的细胞功能（存活、整合以及生理反应性）
. M3 X1 n% f. q9 n4 H I （6）评估重编程细胞状态的稳定性（独立于外源基因、无载体整合）
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体外直接转分化之外，作者认为小鼠体内直接转分化胰腺外分泌细胞为胰岛素分泌细胞的模式，有可能成为体内“原位”（in situ）转分化再生治疗的未来
) S. n0 O K; W# F$ X9 O现实。
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XV。MicroRNAs and reprogramming. Y& L' i) y; P
, H9 z% j% @: H5 {/ |Hao-Ming Chang & Richard I Gregory
1 E+ g" d* j y* ]- z* t) wNature biotechnology volume 29 number 6 june 2011$ v1 m" G# T }3 E$ P
0 A6 ~4 y' e; V$ k目前重编程的热点是miRNA可以单独高效快速诱导iPSC，尽管这个结果仍需要大量研究的证实，现象本身提供了进一步解析重编程机制的一个层面。这篇) I' I1 B5 A8 u- q- \
新闻述评根据有限的研究结果，提出了一个miRNA诱导iPSC的重编程机制的初步图景。- @4 I- [! x6 s# |! G. @, w" c
2 y, ?! w. n$ i' A4 T+ p2 u简而言之，miR-367/miR-302 cluster足以诱导iPSC产生。一系列实验显示，miR-302具有作用于多重多潜能与分化相关机制的作用，包括抑制下列因素：细
0 { T2 W8 {2 `2 _5 i) o胞周期调控因素（CDKN1A，RBL2，LATS2，CDC2L6），EMT（TGFBR2，RHOC），表观遗传调控（MECP2，MBD2，SMARCC2），细胞信号通路（AKT1，$ L B& `0 W5 V1 c! J+ M, R1 z; D
ARHGAP26），膜泡运输（RAB5C，RAB11FIP5）等。而miR-367的作用仍有待确定。与miR-367密切相关的miR-92b可以抑制与人胚胎干细胞周期有关的
( W6 a# H# d- A" b& |Cdkn1c（p57）。这提示miR-367有可能通过促进细胞增殖而有助于重编程过程。5 T- j( D! }1 ^/ O, ~+ m- f$ E
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miRNA的多重作用模式，以及易于合成和转染特点，不引起天然免疫反应，较长半衰期等特点，使得miRNA作为重编程工具具有很大的潜力和优势。- O( t! D, h4 _) a1 [0 S
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XVI。Reprogramming cell fates: reconciling rarity with robustness" Q0 `& Y8 Z) ]% I0 j
, p: j0 {* w4 m: o2 `( ^) g3 I8 V
Sui Huang
6 Y4 M1 `9 n# A. [" P* `5 M' ABioEssays 31:546–56, 2009 May& j3 c; O+ E8 n5 {+ J, \
# c# w% G. L. I; V（所有上述讨论重编程机制的分子细胞生物学思路，基本上是建立在所谓“还原主义”（reductionist）逻辑上的，即任何生物现象都可以还原为某种分子水( E# @1 ~4 v/ j. o
平的线性逻辑关系。这与现代生物医学科学建立在还原主义原则之上是一脉相承的。机体由系统构成，系统由器官构成，器官由组织构成，组织由细胞构成，
3 a A, W9 W+ ]细胞则由亚细胞结构构成，亚细胞结构下则是生物分子水平的内容，再往下还可以还原为物理化学过程。干细胞与重编程机制的研究也不例外，比如干细胞" Z5 D" f; s# v6 M$ `
干性的分子标记的寻找，甚至干细胞微环境也可以还原为某种分子之间互动的关系。在这种思路下，重编程机制的研究就好比在寻找可以把主要事件串起来. {7 {: T* @! V0 ~
的一些分子水平上的“点”及其点与点之间的某种联系。然而，这种逻辑往往在解释整体系统层面的客观现象时遇到理论上的困难。因此，需要系统学、系2 f4 K6 ^! ]" h3 K, ]9 g/ Z' v
统生物学以及理论生物学的模型。这篇概念性文章提供了一个模型，前述Yaenisch的综述文章也是采纳了本文的模型。）
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2 c i& ]' y* `, y) r. `自因子重编程发现到现在的大量研究有一个共同点，那就是大量多种手段和方法证明了iPSC重编程现象本身的“鲁棒性”（robustness）。换句话说，这一8 h \4 K: L, i( v
现象具有高度的可重复性，也就是高度的效度（validity）。然而，与这种高度的效度相反，重编程的效率极低，也就是说只有极少数细胞达到重编程多潜能" m# r% ^" G: E& k. ~: u1 q- h4 X
状态。这种高度鲁棒性和顽固罕见性矛盾，构成了iPSC机制解释的一个难题。换句话说，即使能够基本搞清楚这少数重编程细胞的分子水平以及细胞水平原
: R& v4 B% t1 t @理，如果无法解释并有效复制和控制这种鲁棒性和罕见性的矛盾，就不能说彻底明白了重编程的机制。0 Q/ Y" e0 E; |7 ?0 y! u
! n! c- o8 L7 k ]; Z& e( v: q9 Y- y而现有的分子水平机制研究，假设任何细胞都是可以被重编程的。根据这种假设，之所以目前大多数细胞无法重编程，那是因为我们还无法了解完整的重编 f M6 \/ j* w. q6 [, y3 p
程过程的分子机制，例如表观遗传的“路障”。一旦能够把成熟分化细胞的表观遗传障碍克服，所有的细胞就顺理成章地被倒回某种多能状态，自然就可以8 `% N! C8 S, w+ b6 |9 ~ Q
重新分化为所需要的细胞。
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g" P" T. o3 u" E( R而系统生物学的思路与此相反。系统生物学和理论生物学把细胞的多潜能性和重编程现象看作是一个有着整体调控背景的动态版图，细胞在这个动态版图中+ L: i5 Y+ D+ c6 v; h
时刻处于某种宏观调控背景与局部调控因素互动的“状态”（state）。这里的“状态”是相对于（固定）“类型”的。换句话说，特定的细胞在其环境中可: d, U8 u; G& }3 @& M; v0 S; n$ n
以某种状态而存在，这种状态的维持是由大背景上的小环境动态决定的。换句话说，系统生物学的重编程理论的一个前提条件，是将分子机制的分析单位从
C) {7 b* |& R6 c H) A点对点的箭头顺序“路径”（pathways）改换为“轮廓”(profiles）及其轮廓逐渐的关系。从另一个角度而言，传统的表观遗传“标志”（marks），而系# e; L* a* }4 `; l8 U: w) p
统生物学的观点将重编程中的表观遗传看作是一个由基因调控网络指挥的“谐奏”（orchestrating）的现象。/ Z0 [0 {: w! C9 A2 i m Z, @
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这个基因调控网络动力学具有三个突出的变量：状态空间、变化轨迹以及“吸引力”(attractors）。把细胞的表观遗传用这个概念类比以下，就好比一个动" F9 |/ p, s2 B
态的大平原上，有一些突起的“盆地”，这些盆地的突起边缘便是由表观遗传状态所维持的。盆地内的细胞在周边表观遗传的维持下处于一个动态的活动状
* }& ~1 V% a) n% G/ M态。这个盆地内缘也不是平坦的，而是凹凸不平的（rugged），细胞在盆地内这些凹凸不平的小环境中活动，处于某种相对“固定”的状态。而处在盆地边" L3 w% `$ V4 T3 K5 ~- B- G0 g
缘的那些细胞，在盆地边缘表观遗传状态改变的情况下，就有可能走出盆地，滑向盆地外面的平原上或进入另外一个盆地（另一种细胞类型）。因此，这个
1 W/ C+ `% m/ ~过程就看起来是由整个平原（表观遗传景观）地貌变化引起的“随机事件”。% J. {2 m9 x7 X6 ~: Q( r0 u
% k: Y- M9 f4 h% Q) j' F% ?: W4 D之所以重编程现象本身是很“鲁棒性”的，是因为靶细胞具有大的吸引力盆地，而重编程的“罕见性”则是由于表观遗传盆地边缘障碍比较高，平原状态的
; h+ I' ~! B( D, s0 B动荡以及盆地边缘地貌的起伏不定等因素的阻碍。这个模式可以用数学模型结合现有的基因调控、表观遗传修饰以及转录调控等数据加以量化。该文采用了: S4 }5 `. [( Z) [" z
直观描述性数学概念来简化说明这个模型。在这个模型下，可以比较好地解释一些现象，如重编程的“随机性”，细胞状态、表观遗传调控以及转录调控的
k& V/ I/ _. ]: s9 U- A对立双极机制（bivalent），基因表达的多样性噪音（noisy heterogeneity），单个细胞在细胞群中的动态存在及其身份状态转变等。
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9 @( C3 d$ B3 Q" z8 S: R* j+ t, A从经济有效原则来看，这个模式也预测最好的重编程之路不是完全倒回到彻底的多潜能状态，而是在相邻的盆地之间找到细胞状态的转换途径，这很类似直]
6 e& U0 Q- u3 p0 ^6 k4 a接转分化的思路。另一个具有实用价值的思路，是某些小分子药物来扩展（多潜能）盆地的尺寸，有可能提升重编程的效率。
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（对于传统分子生物学体系的研究者而言，这种系统生物学模式还属于开脑筋类的读物。）
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综上所述，iPS以及广义的重编程现象已经到了必须加强机制研究的地步，现象学的操纵仍有余地但也有赖于理论框架的支撑。近来综述文章中关于机制的部
- \4 }4 N, [5 o5 E$ W6 R% J5 B3 x分分量越来越大，证明了这一点。" y" b4 ^9 F' D6 o: l( n
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总体而言，iPSC重编程的研究，与胚胎干、表观遗传等研究进展呈相互推动的态势，并非是完全独立的过程。核心多潜能因子及其多重水平的复杂作用，以3 A: J3 @% s( A( o4 b8 \9 C# k y
及与表观遗传的关联说明了这一点。而基因技术的进展提供了前所未有的手段来解析更深层面的现象。
, x" r& R0 e! a. @
* `9 ~0 U* h5 d: ^, D6 ~1 { |7 K一些苗头：细胞“状态”vs.“实体”；多能重编程为直接转分化铺路；线性分子机制vs动态全局调控；全局表观遗传改变vs局部修饰等。8 k1 e! i3 `8 i3 \
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“机制”可以从多种层面来考虑，从宏观到微观——思路、模型、假说、操作性模式；终极分子机制现象。终极的技术手段：单细胞高分辨率时空序列结合多! o& A( z( B) ?+ u
层次分子技术平台；以及系统生物学模型指导下的方法。
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研究重编程机制，对实际应用的影响：提高效率和效益、更有基础的安全性保证、质量可控性、模式化规模化的产出、导向更基本的物理化学手段、寻找更直
" A2 u, E. n/ S# r0 B$ J接的细胞转化之路（直接转分化），以及体内机制放大与利用（体内现场重编程）。$ H. @+ B! [5 I
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对重编程机制的认识，对建立高效规模化标准化的诱导与分化protocol，高效完善的系列质量检验与控制体系，植入后的监控与调控，模式化与扩展，应用目
0 ~0 C/ S2 c7 B标与途径的合理界定等都是至关重要的。: J+ ]/ O% I1 T1 j# ~6 N
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目前的机制研究，仍处在寻找合适的阐释框架上，这个阐释框架不仅需要整合现有的数据和经验，而且能够预测并包容未来的新现象，起到指导重编程研究与7 `) a: i- B9 {' x. e- G" ?0 s {
开发的作用。从这个意义上，上述机制探讨还很初步。
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至于重编程在生物学本质上、进化上具有什么样的意义，那是另外一个问题。
7 G" E. n9 E+ O) Q. S
2 B3 j3 r2 p' n, d& L（字经三写，乌焉成马；语经三传，其言必讹；书经三评，不啻代刀。还是要读原文。）
- r, J) s) _* V( }7 l8 K( x2 v（仅供参考，不负责任，请勿引用、转贴）
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" E7 i) A, `2 E4 a, p! z
# x: v* i' z0 j( J
/ |* O8 P5 A& S0 c（一图千言，抽取一些文章关于重编程机制的图页，做成一个文件，供参考。）
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发表于 2011-6-29 18:10
发表于 2011-6-29 20:40
