经历两次BMSC提取失败后终于看到曙光，在此感谢大家的帮忙！分享一下实验改进

taoli10000

上次发帖求助，多谢各位的建议，终于在这一次提取BMSC看到希望，讲讲我的实验改进吧。。。分享一下，也希望大家给点进一步的建议
2 O; p" `) F9 h' l; ^# }2 u1 最初是提取长骨和股骨，每根骨头放T25一瓶，感觉细胞密度太低，然后就改成两根骨头放一瓶，长骨和股骨分开，发现股骨的活性要号很多，密度要大很多，提取的股骨细胞大约5天就长满# ?" V' ^( U( {2 _" b; l
2 血清浓度由大约10%提高至20%，打算在传代时再用10%，明天看细胞状况，希望它们健健康康
0 n0 {1 i5 m7 X* v( O3 考虑到谷氨酰胺的可能影响，在买的GIBCO的培养基中另外又加了1%的谷氨酰胺, ^3 W: T4 U$ M' ~, b
4 在配培养基的时候竟然忘记加双抗，不过庆幸的是细胞还好没有染菌。) m8 v9 }; t3 c4 R- \: R2 j0 I

" x3 Y* a5 R7 L* J5 W( r' \. d目前准备传第二代了，想要确定到底血清还是谷胺胺酰胺有多大影响，希望各位给点建议哦！感觉两根股骨放一瓶T25密度还是挺大的。第一次传代一瓶T25传了一瓶T75，大概三天就可以铺满。。。$ y6 A& _) H$ q1 R- U' I. h
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呵呵，开心哦！等待准备接下来的实验，希望一切顺利！再次感谢大家喽！

皮搋子

LZ请考虑一下，三天长满的话是否密度太大？
3 P% B- Y) h, O2 B, N1 @( U$ F' w: J7 D6 x$ U3 X. t
这个时候细胞还未伸展开来，大部分都是圆形。这个时候传代的话细胞状态不好，过了几代就开始老化！

iceyang

养大鼠的BMSC其实不难，我一直就用普通的DMEM+10%FBS+双抗来养，很好，传5-6代没什么问题，一般一只大鼠的2个股骨和2个胫骨接种一个10CM的大皿，2-3天初次换液，6天左右1传2或者1传3

taoli10000

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" g; }* I& S5 L6 m- K( C/ i不啦，细胞不是圆形的，应该是P0的时候需要比较长时间，后面的话应该差不多3到4天，早晨刚刚看了，一片一片的漩涡状细胞，完全长满， 状态应该没错。嘿嘿，谢谢你的建议，我考虑过，感觉细胞密度确实有点大，我都是1传3，但是又怕1传4养不活。。。

taoli10000

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' Z2 R" S* Q# J4 n5 i  V8 h; _( b1 `$ l! ?/ [
嗯，养起第一次后面就有信心些啦，打算逐渐放宽条件，让它们在艰苦点的条件下茁壮成长。。嘿嘿

gact

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发贺电，，，B-MSC是mouse的？
, o& W; Y. e' B

yishengyouwoly

回复 taoli10000 的帖子' b$ u; y: ^+ `( w

& ]* D; s" n: F/ z5 U& B, a, X7 d3 m恭喜你养这么好，你养的是sd大鼠吗？用的是全骨髓培养法还是密度梯度法？我是用全骨髓法，感觉杂细胞多，而且p2开始细胞形态就不好了。有战友建议用密度梯度离心和GIBICO的血清培养。

1301918986

回复 taoli10000 的帖子+ `/ R8 D& ]" b9 r; y
+ u4 {7 y! R$ j2 ^+ d3 A
谢谢你的分享，我最近在养兔BMSC，原代总是那么不顺利。看了你的实验下次在改进一下，希望能成功。

taoli10000

回复 yishengyouwoly 的帖子! z, Q, [% i( [0 }3 m; ^" h

; v, L! F7 r% ^3 s: a我用的是SD大鼠全骨髓培养，后面的细胞鉴定还没做的，据我了解一般都是在第四代的时候做流式可以达到百分之九十几了

taoli10000

回复 gact 的帖子
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Rat的，呵呵6 K* A1 {& `# F