经历两次BMSC提取失败后终于看到曙光，在此感谢大家的帮忙！分享一下实验改进

taoli10000

上次发帖求助，多谢各位的建议，终于在这一次提取BMSC看到希望，讲讲我的实验改进吧。。。分享一下，也希望大家给点进一步的建议2 I9 O0 o) R4 [: U
1 最初是提取长骨和股骨，每根骨头放T25一瓶，感觉细胞密度太低，然后就改成两根骨头放一瓶，长骨和股骨分开，发现股骨的活性要号很多，密度要大很多，提取的股骨细胞大约5天就长满- K% {4 w8 ?4 |7 q4 {( H( O
2 血清浓度由大约10%提高至20%，打算在传代时再用10%，明天看细胞状况，希望它们健健康康
6 ~: m5 O  }0 p! j. P1 L; u3 @3 考虑到谷氨酰胺的可能影响，在买的GIBCO的培养基中另外又加了1%的谷氨酰胺; m& x+ z9 d. \
4 在配培养基的时候竟然忘记加双抗，不过庆幸的是细胞还好没有染菌。; z6 D4 _4 R# S. _9 G; X! l

* e: M$ V; O( @. a5 y目前准备传第二代了，想要确定到底血清还是谷胺胺酰胺有多大影响，希望各位给点建议哦！感觉两根股骨放一瓶T25密度还是挺大的。第一次传代一瓶T25传了一瓶T75，大概三天就可以铺满。。。, D2 y- r1 |4 N/ v1 S6 S

9 R) [. _$ z; @呵呵，开心哦！等待准备接下来的实验，希望一切顺利！再次感谢大家喽！

皮搋子

LZ请考虑一下，三天长满的话是否密度太大？" U9 t( C1 D/ E2 u$ l

. K0 u2 v$ B" X$ D+ D: {这个时候细胞还未伸展开来，大部分都是圆形。这个时候传代的话细胞状态不好，过了几代就开始老化！

iceyang

养大鼠的BMSC其实不难，我一直就用普通的DMEM+10%FBS+双抗来养，很好，传5-6代没什么问题，一般一只大鼠的2个股骨和2个胫骨接种一个10CM的大皿，2-3天初次换液，6天左右1传2或者1传3

taoli10000

回复 皮搋子 的帖子( |* [' l+ Z% P/ W& N0 Z

4 r$ R4 @& A% X' v1 A% B8 ^不啦，细胞不是圆形的，应该是P0的时候需要比较长时间，后面的话应该差不多3到4天，早晨刚刚看了，一片一片的漩涡状细胞，完全长满， 状态应该没错。嘿嘿，谢谢你的建议，我考虑过，感觉细胞密度确实有点大，我都是1传3，但是又怕1传4养不活。。。

taoli10000

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. `/ ]& b( ^/ Y" Q5 |4 H7 k
" T2 j- @/ H/ V" O" J2 S: ^嗯，养起第一次后面就有信心些啦，打算逐渐放宽条件，让它们在艰苦点的条件下茁壮成长。。嘿嘿

gact

回复 taoli10000 的帖子% L. \8 y& ?% q
3 z: \' t" b+ m0 q6 E) N, p, q9 b
发贺电，，，B-MSC是mouse的？3 a$ D5 ]& P/ H. @: Z/ m' j3 G

yishengyouwoly

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* R1 V" `* S5 D- a* G
+ r. o2 M4 K' V% o恭喜你养这么好，你养的是sd大鼠吗？用的是全骨髓培养法还是密度梯度法？我是用全骨髓法，感觉杂细胞多，而且p2开始细胞形态就不好了。有战友建议用密度梯度离心和GIBICO的血清培养。

1301918986

回复 taoli10000 的帖子6 H* H2 |5 R8 ^7 V+ H6 i
7 N9 Q6 L9 k' B8 r: |& S5 j
谢谢你的分享，我最近在养兔BMSC，原代总是那么不顺利。看了你的实验下次在改进一下，希望能成功。

taoli10000

回复 yishengyouwoly 的帖子
- n" k6 b0 `# }8 f% k" g: L
; \3 B0 x8 d% A) m我用的是SD大鼠全骨髓培养，后面的细胞鉴定还没做的，据我了解一般都是在第四代的时候做流式可以达到百分之九十几了

taoli10000

回复 gact 的帖子. h! v2 H7 r* Z, M7 k/ C9 [& t" `( |
) E. k* l) X, m. A3 P. D- K5 t
Rat的，呵呵
7 B+ S2 f1 I: f1 y