基于载体的miRNA抑制剂表达克隆方案

runsong

本人想通过慢病毒表达miRNA抑制剂，不知各位高手有何良策，不胜感激。
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注：一些公司如复能基因推出过一些产品。但我问过，一个载体两千多元，老板是不会同意的。所以我想自己构建，基本构想是基于PLL3.7，模仿miArrest™（http://www.fulengen.com/product/mirna/inhibitor/），但其中的细节我查不到资料，如果有人能给以指点，万分感激。
/ Z% v6 I4 b* u- D! m! S8 n( a       本人经过一年的打拼，在慢病毒包装，小RNA方面积累了一点实验材料与经验，希望与各位战友共享。

深海寂寞鱼

5 O# y! ]$ J, L% ]) `1 P
  to runsong兄:
+ q) A/ L9 m6 T& S
! ?! ~  ~0 f, K4 o  建议你用miRNA sponge, 简单, 好用.( Y4 ]/ s( J$ M" p, G1 t. F
2 c9 y/ `" n! a
  具体的方法我就不给你啰嗦了.$ M# E/ V& o1 ~) I0 e

7 P  Z% P! M; I/ }/ O  直接把nature protocol给你. 里面写的非常详细.
! f+ z# B" G/ G# r( t
& ~% E4 M5 ~0 D" }  而且以你的经验做起来不存在任何问题.
% [! M1 d% h  y6 d8 }! g- E) P  u
+ C  M0 x- q5 m: x, t$ W/ c  你先做做看, 有什么问题继续交流.
; T) m; S7 _) Y! I# x
: t" q& t7 i/ A6 _  看来你的实验是一步一个脚印啊.

深海寂寞鱼

* p+ H1 C8 t) U) f- x/ b" z4 b$ Q: A' I7 T1 ?" \) Q
Nature protocol 全文:) W. E/ A9 c0 x+ ]4 o: i
% A. i& @# v6 E) ]/ `9 l
MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. p$ p6 f! t# r6 T

: X2 E: `: G! z& k1 M

runsong

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9 Y  m/ \! d% ^/ x( U# e2 q/ u& F- {3 \, d2 M! d
谢谢大师兄

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子4 u+ a% c9 E1 E
9 ]) ]# `: X- n) r& @
那我就把海绵加在pll3.7的U6后面。
* P+ s- g5 m7 p4 o8 A+ ~+ J5 o不过还想请教一下，如何经济高效地实现海绵单元的重复？

深海寂寞鱼

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, ^  B$ V# G, C% P0 e" K* r( z/ m( q& f) S, m; O  }
$ ^; l' c: s2 ?; `+ _% W. l( {
   to runsong兄:
6 C8 A0 ?* ]) K* |0 j5 n: S4 I; U9 }; F! L6 \: \5 J
   你问问题总是会问在最最关键的地方啊.
+ e( p, D# M0 M5 a* S( p
% O9 {; y/ U& @   想高效,就花钱,直接做基因合成,方便高效.省时省力.
* g. x. e& C- Z* T
: w! }1 n  g% x% s& q+ L   如果想经济, 就用多片段合成,然后退火连接. 稍微便宜点.  但是加上时间/人力和其他试剂,也不会太便宜.
3 Z' M* [& |( C7 d8 ?7 o0 K3 R6 f  G) z. j  I5 z  _

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子% H* ^0 H# z1 ?, E

0 f/ A( n! t* C# A不好意思，再打扰一下。你们的海绵单元一般重复几次啊。
6 {; t- ?3 H0 e' T) v其实我以前一直想做海绵，就是卡在经济高效地实现海绵单元的重复这里。

sannia

这种方法还没有经验 过来学习一下

深海寂寞鱼

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6 M0 b. a: ]- v" `
  Y! `9 Z* [1 a$ a
  h2 Q. |, }4 F7 E: o         to runsong兄:
7 i/ j* m$ f" n6 p
' D8 w( V0 P$ L" @7 m" |  1.  回答你5楼前半部分的问题:  ?, w1 s3 W9 |2 p/ G
) {# Y! W$ p/ b  @& m
       把sponge插入到U6启动子或者EGFP的后面都是可以的.+ t& a' x6 U6 F- L( c8 w

) X' w1 a5 N, v6 t. C7 z* \% z# L       我上传的文章中也有提到.关键看你后面的目的.
' X4 _8 j9 j0 a  F2 v0 _       如果放在U6的后面, 你为了终止转录还需要加上一串T . 势必会增加合成的长度.+ V9 `8 B7 p# t4 C3 A
8 p. }9 {! M) R, _$ l3 U3 p% w
   2. 至于sponge重复几次, 这篇文章中是重复7次.
9 @) a; i* d- K( l) ~/ z$ Z! ^# ]! ?* z; T
       所以你先考虑做7次的重复吧.
5 t# v8 q& s! h7 H+ j6 N! _; c
% Q# I+ p$ {3 s/ }       至于少重复几次到底会产生多大的影响, 我还没有这方面的经验.# c% o$ i- q1 G: Q( N1 ?/ ]

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snokey

实验室有人用合成的siRNA 来target目标miRNA的loop部分（听他说一定要cover到pre-miR中有空泡的那个部分），大概能knockdown 70%以上的活性。他没有做成病毒载体，如果把他用的miRNA序列做成病毒载体，应该效果比siRNA效果好吧。