基于载体的miRNA抑制剂表达克隆方案

runsong

本人想通过慢病毒表达miRNA抑制剂，不知各位高手有何良策，不胜感激。
; ^% b; a; W$ d! c" ]
8 z4 z, c# `4 E6 `+ C注：一些公司如复能基因推出过一些产品。但我问过，一个载体两千多元，老板是不会同意的。所以我想自己构建，基本构想是基于PLL3.7，模仿miArrest™（http://www.fulengen.com/product/mirna/inhibitor/），但其中的细节我查不到资料，如果有人能给以指点，万分感激。
' B9 {7 z8 W, k5 S4 x       本人经过一年的打拼，在慢病毒包装，小RNA方面积累了一点实验材料与经验，希望与各位战友共享。

深海寂寞鱼

! @; g4 `' @5 p4 p
  to runsong兄:
. ^% [2 r8 F# d  p1 F9 ~
5 U, s3 I, j9 C' R# b  建议你用miRNA sponge, 简单, 好用.& f6 J' J8 ]  i% J0 G$ T
1 d4 ], T; u) C4 e4 s
  具体的方法我就不给你啰嗦了.
9 F7 W5 W  F" w6 q' w% Z
8 W1 h/ |2 F1 \/ E, U7 u  直接把nature protocol给你. 里面写的非常详细.
( o6 ^1 G2 {; X- _9 w! U2 ~% o8 m& s9 w$ n+ _* r* h" F4 h
  而且以你的经验做起来不存在任何问题.
) X! S# [4 O* H) w" @! |' I" D3 f6 q- |0 r
  你先做做看, 有什么问题继续交流.' K2 y2 ?5 E5 r& v' _

( M, a# l* v7 h: [; s: Q/ I' V) G1 Q# X  看来你的实验是一步一个脚印啊.

深海寂寞鱼

  o& ]2 M" k, y5 F4 s, V8 G7 ^5 |: H
Nature protocol 全文:/ X2 ]  ^2 u5 ^4 t% A" E

1 C6 G8 L2 e, m% P+ |1 cMicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells8 u+ ]. i  f4 o5 t; q# x7 A) ?5 ]2 z+ ]
+ A* j9 A1 L) E) w+ v

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子
; c8 ]: ~1 U( L- [- i
- v3 I9 G& y6 O- f: s$ n谢谢大师兄

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子0 r9 m7 {  r7 o1 _  E5 z: q( S
0 H+ c; w+ D- L& `" F& h( ~
那我就把海绵加在pll3.7的U6后面。
; Q$ ?" @( N  h* R- ^不过还想请教一下，如何经济高效地实现海绵单元的重复？

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子; @' A$ P) O/ _& e0 i, y; A
+ ~' Z8 l, @1 |

0 }7 c& v6 i9 A% D! z) a   to runsong兄:
. X( l3 }. m( G7 ]$ U4 a6 r$ |; u  p5 `* O4 M+ G* m
   你问问题总是会问在最最关键的地方啊.
" c) q; u# r5 ?3 p
; e. v1 g9 h! A/ h; u- Z- ^   想高效,就花钱,直接做基因合成,方便高效.省时省力.. Q, K' T9 ?( @! W/ L. w1 Q. B' P. T

! N, ?9 L7 ]2 \4 S' l8 i4 O   如果想经济, 就用多片段合成,然后退火连接. 稍微便宜点.  但是加上时间/人力和其他试剂,也不会太便宜.
, G" d0 O& o# e( u0 b
9 d$ k9 Q; ]9 h" g: D% B

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子. Y; z6 K( E) d# X! ~% I. j
: @5 V+ H1 q9 w" g. r
不好意思，再打扰一下。你们的海绵单元一般重复几次啊。' [) }: Q$ W  Q5 j0 M$ D4 C. Q
其实我以前一直想做海绵，就是卡在经济高效地实现海绵单元的重复这里。

sannia

这种方法还没有经验 过来学习一下

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子6 g9 s6 c5 l. H+ o

1 Q8 x) V  d5 T4 `3 J+ k( n! `0 [# R) @3 f) E) F
         to runsong兄:
  T7 R7 G: S& w9 v0 l5 w9 y4 o
! d. F, Q4 ~& l& U  1.  回答你5楼前半部分的问题:  ~! t& f" q! a& h5 q8 P* l

4 g0 B8 @& r* s       把sponge插入到U6启动子或者EGFP的后面都是可以的.
# K7 _- T" x2 i" S2 |( w. V" r1 C* k; T4 X* N$ q
       我上传的文章中也有提到.关键看你后面的目的.
. F2 E9 q- d0 A6 P, M7 x       如果放在U6的后面, 你为了终止转录还需要加上一串T . 势必会增加合成的长度.) E  ?' F/ |7 p0 Q
* i9 q3 r- Z3 V1 _2 D6 a( S5 b
   2. 至于sponge重复几次, 这篇文章中是重复7次.
' U: k* r& z, A6 w* h
- X# |1 L: B3 V# v3 F) \! O4 O       所以你先考虑做7次的重复吧.
6 W  p8 g+ G+ G  {5 ~
& d6 r5 C- v3 k2 O( v1 S       至于少重复几次到底会产生多大的影响, 我还没有这方面的经验.5 Y1 A% P2 M: F3 a5 @6 Q

* M1 A1 Y+ K5 t9 j. P

snokey

实验室有人用合成的siRNA 来target目标miRNA的loop部分（听他说一定要cover到pre-miR中有空泡的那个部分），大概能knockdown 70%以上的活性。他没有做成病毒载体，如果把他用的miRNA序列做成病毒载体，应该效果比siRNA效果好吧。