基于载体的miRNA抑制剂表达克隆方案

runsong

本人想通过慢病毒表达miRNA抑制剂，不知各位高手有何良策，不胜感激。3 E4 q+ W# j: {( w8 l* F' d* v7 E
- }0 [% a3 u2 B+ m" W, K2 x
注：一些公司如复能基因推出过一些产品。但我问过，一个载体两千多元，老板是不会同意的。所以我想自己构建，基本构想是基于PLL3.7，模仿miArrest™（http://www.fulengen.com/product/mirna/inhibitor/），但其中的细节我查不到资料，如果有人能给以指点，万分感激。- E- R+ T% N* T" q4 ~
       本人经过一年的打拼，在慢病毒包装，小RNA方面积累了一点实验材料与经验，希望与各位战友共享。

深海寂寞鱼

8 K$ `/ ]8 \- I" H# B9 z; \! `  to runsong兄:
: E! o4 J" M2 q$ \9 Z3 E! L7 q5 y) B" {. W9 y4 y+ M6 p
  建议你用miRNA sponge, 简单, 好用.
3 N/ g. s: q9 H& a" @$ h1 T/ p( I& P
  具体的方法我就不给你啰嗦了.
* j( r. u2 Z  F  s' I1 g6 `) n% ~. Z7 a) `! }4 _, ]' `
  直接把nature protocol给你. 里面写的非常详细.4 Z3 n% |2 M) u( J
0 ~. ]  B2 Z% `
  而且以你的经验做起来不存在任何问题.
* O) v1 n5 i/ Y3 x
2 }+ W8 J( _) u% Z6 d# {4 f4 c) ?  n  你先做做看, 有什么问题继续交流.
" f2 {8 H& m3 ?) l
3 d* z, P/ C# G; r  看来你的实验是一步一个脚印啊.

深海寂寞鱼

' ~9 S( l6 V, c3 L* ]
7 _6 M4 p! s( d
Nature protocol 全文:
( {' m9 S, w- v# {4 w
7 \/ ]- A7 A9 _MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells
+ E, x' T5 a/ s$ j( Q8 `' T5 B  Y
% d0 ]0 V* d& q0 a2 G

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子# v, Y, _; K9 @, h0 b2 E/ n' l' ^$ V

: M0 R- Z$ d8 V8 w# c5 ^! l谢谢大师兄

runsong

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+ R* P- k0 @. f, G- E$ c( `* m$ Z  k# A: u. Q$ ?7 T$ d
那我就把海绵加在pll3.7的U6后面。! q# J* d2 p7 Q; ^) y) b
不过还想请教一下，如何经济高效地实现海绵单元的重复？

深海寂寞鱼

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# }: N; G4 G. ~
. S2 {  f& V7 Z$ P: p1 H# H/ E4 b& V1 C" k( O  `0 y4 K
   to runsong兄:+ Y. U5 C9 G! `" {* @( @

8 T; M9 B! k4 W4 y$ [- v; e( u  J7 s   你问问题总是会问在最最关键的地方啊.  z: O: i" g# L, }" C8 x) O

* v5 f/ g0 l; K" x* m7 e   想高效,就花钱,直接做基因合成,方便高效.省时省力.5 @* I; y  r* D0 D* x
- q# x0 _( q# U& s* M& F! F
   如果想经济, 就用多片段合成,然后退火连接. 稍微便宜点.  但是加上时间/人力和其他试剂,也不会太便宜.
/ c! F: T0 v( G) _
% N5 x$ u! l; x4 J. @

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子2 |1 ^) R+ g7 E6 `) I) |

. R/ r' q$ b, ?: v7 j- X$ I. k6 Q不好意思，再打扰一下。你们的海绵单元一般重复几次啊。
; h/ P& \: z, e! \5 X3 B其实我以前一直想做海绵，就是卡在经济高效地实现海绵单元的重复这里。

sannia

这种方法还没有经验 过来学习一下

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子, n! ]) n% R$ G! i5 z  B! c3 u2 b

' I# M' F% d5 N
/ [# O1 S+ w4 ?3 ]3 D6 V1 w+ Y  C         to runsong兄:
3 K2 u/ [* @( O6 w% E; T, N' ^2 `# c
  1.  回答你5楼前半部分的问题:
4 E5 a' X( D" E
3 J2 W0 G8 N' Y       把sponge插入到U6启动子或者EGFP的后面都是可以的.& k! k) z4 ]7 E) @2 D$ h

! O( @) _; V- c4 s& \       我上传的文章中也有提到.关键看你后面的目的.2 ?5 }8 x8 q5 z7 n7 z
       如果放在U6的后面, 你为了终止转录还需要加上一串T . 势必会增加合成的长度.
- {7 ]. A% z5 h# Y7 W: L! j/ I* g9 [6 _/ ^, s, x" v1 e* }3 G
   2. 至于sponge重复几次, 这篇文章中是重复7次.1 U4 z* |5 j# C) ~0 x) a3 H( A! {

( D$ H; A3 K! L$ D       所以你先考虑做7次的重复吧.
. r$ q1 l% _/ o7 S, j, T/ h" T! l
, c8 ^8 n$ ^1 B$ Z+ B       至于少重复几次到底会产生多大的影响, 我还没有这方面的经验.
' n8 H$ ]) `4 l0 Z- k/ g: R6 B

snokey

实验室有人用合成的siRNA 来target目标miRNA的loop部分（听他说一定要cover到pre-miR中有空泡的那个部分），大概能knockdown 70%以上的活性。他没有做成病毒载体，如果把他用的miRNA序列做成病毒载体，应该效果比siRNA效果好吧。