胚胎干细胞培养时，有无滋养层的差别

rain2402

请问各位，胚胎干细胞培养时，有无滋养层的差别，现在是不是无滋养层培养的技术已经很成熟了？是不是可以像普通细胞那样培养了？谢谢指点

dongxin

我小试过用Matrigel包被的培养皿来培养hES细胞，效果还可以。
$ s& s6 [9 A! a1 S具体如下：用丝裂霉素C处理MEF（过夜），加入 bFGF的hES培养液，孵育过夜，即得CM(再适当加入一些bFGF).
% X8 o4 S& N/ A5 ]! w; K我也是刚刚起步学习，希望可以互相交流，进步！+ I6 ?( q, O2 S2 `- g

anxjs

ES和iPS都进行过无饲养层培养，感觉两者差不多，我用的都是matrigel铺的板子，培养基是自己收集的条件培养基。mTeSR是stemcell公司研制的专门用于ES细胞无饲养层培养的，质量应该优于条件培养基，但是我们觉得价格太贵了，而且无饲养层培养只是个短暂的过程（只用于实验，不作无饲养层长期培养），条件培养基短时期还是能保持ES/IPS不分化的。ES/iPS无饲养层培养时，仅用明胶是不能保持其未分化状态的，有时候甚至贴壁都很麻烦，而matrigel除促进细胞贴壁外，里面还含有一些因子以促进ES保持未分化状态。

开心果王

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* B9 ]# z" p2 J5 p  f1 S& b  m/ B+ ?4 X6 h) d
mTeSR购自stem cell公司，500ml的话在3000元左右！我上面说的就是用它+matrigel培养hiPS&hES的问题。至于miPS feeder free状态下培养的话，可以用gelatin+N2B27+2i，效果也不错的！

yylhxylong

我们都是在明胶上铺上一层MEF，可以防止干细胞分化，MEF可以分泌一些生长因子，例如Lif一类的呀，可以抑制干细胞的分化促进增殖~

dilal

回复 开心果王 的帖子' a" }0 ]( B% z" ~# Q8 F
# s6 Z6 M) q) N6 ~( q4 r" h& H
不知道你用的mTeSR，是从哪里购买的？价格如何？你用它无饲养层培养过小鼠的ESC吗？- |1 s4 D. H, p+ \
能否反馈一下你们的培养效果，好让大家都借鉴借鉴。

dilal

回复 开心果王 的帖子) B; i, k( M: F

; q6 P% R2 c" M没试过用matrigel，我们用的是明胶，还没有尝试过无饲养层向饲养层的转换。不过，我前几天将以前冻存的无饲养层培养的ESC复苏到饲养层上后，细胞状态还可以。# J3 y5 ]; a  s' y
我们尝试过将iPS种在明胶上，没有成功。matrigel常常用来培养hESC，感觉效果比明胶要好许多。

开心果王

回复 dilal 的帖子- C5 i  J+ Z4 y9 I2 S* b8 x) @7 H
3 U; X( A* t% ~$ Q8 i# A9 F/ H& M! i
多谢dilal的经验之谈，请问有木有试过将matrigel上的ES换到feeder上，我最近尝试发现这样做很容易导致分化的，传来两代了，还是有很多分化，估计要挑一些克隆了！还有就是我用iPS在matrigel上也能长，用的是mTeSR，效果还不错啊！不知道dilal是怎样处理的！

runsong

加入gsk3抑制剂及Mek/Erk抑制剂再加入lif可以短期维持无饲养层培养。/ I* L: _  o# a5 p4 t3 `# ~
我们这里用lif+gsk3抑制剂养得还凑合。

dilal

胚胎干细胞培养条件比较苛刻，各种因素都可能影响到细胞的状态，包括孵箱条件、培养基质量、血清（常规需要对血清促ESC增殖及维持ESC干性作用进行检测鉴定）、饲养层状态及接种密度、ESC接种密度等。
, j! A9 H4 w3 ?2 u$ M9 ?* Y' }, r" h饲养层培养的目的就是通过MEF分泌一些因子促进ESC增殖，同时抑制ESC分化，当然培养过程中光有MEF是不够，还需要加入LIF或bFGF细胞分化。饲养层培养的优势在于：ESC干性维持较好，细胞分化相对较少，利于ESC长期培养；缺点在于：操作麻烦，需要同时培养两种细胞，而且细胞的掺杂对于后期实验具有一定影响及混淆作用，需要进行纯化。" i! r; s( q- ]! f# \: _
无饲养层培养与饲养层培养唯一的差别在于：去掉了MEF，培养瓶需要预先铺上细胞基质（如明胶、基质胶等等）。至于LIF或bFGF添加量各个培养手册上推荐的不一样，有的说和饲养层培养同样添加量，有的推荐添加量需加倍（限于小鼠ESC，人ESC无饲养层培养需要加量）。无饲养层培养的优势在于：更接近于我们理想的培养模式理念（无血清无饲养层培养），无细胞掺杂，更有利于后期实验及诱导分化；缺点在于：无饲养层培养的ESC较饲养层培养容易分化，不适合于长期培养。
# ^. F3 ]; P- l" o0 ?# z3 Y/ |饲养层培养的ESC细胞受饲养层限制形态趋于圆饼形，而无饲养层培养的ESC相对比较扁平。两种培养模式都有各自的优势和局限性，我觉得大家需要根据自己实验的需要加以选择。个人比较推荐：长期培养时采用饲养层培养，为实验预备的短期培养可以采用无饲养层培养（实验前1周进行饲养层向无饲养层的驯化）。但对于iPS细胞就不要用无饲养层培养了，我们以前尝试过，几乎没有贴壁的细胞。
, e, n  L& S. Q' I  x3 S以上建议属个人总结的观点，如有不对请更正。