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fwyou

想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

linlicau

fwyou 发表于 2011-8-1 21:15 , ]9 h, o4 R- M, g0 P8 B( e, n2 I; E) S
想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

& N$ z4 Q* Q4 k/ [$ y' K7 y: Q
什么叫扩增效率？- e( c8 W. U. `2 Q! e' g4 b

3 h6 c0 l3 L' p( c* {( r  F在做qPCR是要先test你的qPCR引物，看其是否特异。也就是在对照组（加水）和实验组中（一般每组3个重复即可。）先test一下引物，看峰是否单一，C（t）值是否合适（如果此值在实验组中为35以上，要么说明引物扩增效率不好，要么说明此基因表达量很低。）。对照组水中的C（t）值应该为N/A，或者在38以上为好。

johnnymmzhrt

回复 fwyou 的帖子  V! @! U; v+ d4 @0 P) d' I1 K

! l5 N1 T7 p; l8 [" j' _+ O# c4 D你是要评估引物的效率还是别的什么？如果是引物效率的话一般三到四个重复就可以了
4 b$ R" W# l- _9 S1 P' `/ ~但是貌似扩增效率这个东西很难评估的吧 不同的引物 不同的模板 不同的缓冲液配比都不一样 甚至连不同仪器之间都会有差别的吧。。。

fwyou

呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！
  G1 K7 l5 x+ k$ J' T. [每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？
' L/ N2 D* c0 W& y
3 _1 e: j4 |/ h9 S9 n7 A) [谢谢啊

fwyou

回复 linlicau 的帖子8 j- N, I: x  j9 h7 k. y
) T4 r0 L$ u. F7 u
呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！
- i2 t; W. p3 p2 n& G1 r  f* `每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？1 A$ M' E" ^/ G* I5 d
- p4 C; D; o$ B6 o$ F" ~" e
谢谢啊

fwyou

对了 模板还做梯度稀释吗？

linlicau

/ w5 N# L$ o9 T' ^) q& Z9 @

fwyou 发表于 2011-8-1 23:58
2 L. |: ~0 J7 J# M$ F回复 linlicau 的帖子
- k! Y; ?% l+ w- F
, w* e$ _1 f' f) d9 N9 M呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个 ...

8 [, t% m* o- ]- V, H9 T% O
3 V. z5 s! J5 Y% L. N* q
同学，可能是我没有说清楚。我再详细说一次吧。
" g6 |4 m$ [8 q; @7 W- ?$ L
$ {4 J% X; I  S+ o. T在真正的用qPCR做基因表达检测前，需要对用于检测该基因的引物进行测试，测试的目的主要是看此引物是否特异（特异的意思就是只能PCR出你要的基因中的片段，而不是其他基因中的片段），0 [/ `+ M& j' c$ x* z+ a# A

' p, j3 y& F; |& c' b3 i' I+ |特异的检测标准一般就是：你做两个组，一个是水空白对照组，即：其他成分加的都一样，只是template只加水，三个重复即可；另一组是实验组，也就是template加入的是应该包含你需要检测基因的cDNA, 三个重复即可。是不是特异就看：加水的组本应该没有检测到任何的表达，C(t)值应为N/A；而实验组应该有表达，并且你在看melting curve的时候应该是单峰，没有别的偏峰。且最好实验组的表达的C(t)值应该在35以下。然后，等realtime PCR做完，最好跑个gel验证一下，是否实验组只有一条带，且这条带的大小应该与你设计的大小一样，比如200bp（一般realtime PCR片段长度为100-300bp）。
6 i* |4 Q' w5 C9 R3 n& p" N7 M
. X1 D/ a7 ~9 L; W. x( f: n) X如果这些都ok了，那么你就可以做你自己的实验了。3 \0 C1 R/ ^3 K; z5 F& X

; I( ?. H  P1 s; A. K- X& b在做你自己的实验检测某个基因表达情况时，最好每个样品做三个重复，并且同时要做ACTIN或者GAPDH作为reference，最后要对通过实验组对这些reference基因normalize之后得到你要的相对表达值。你就可以看到在不同组织或者不同时间你的基因的表达情况。

fwyou

回复 linlicau 的帖子5 a( [4 `5 c% U  f7 O. L3 I8 [

1 x( W0 p" T( L9 ~% F非常感谢 。。。。

echowdk

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6 d  w2 D8 H9 [( V% i7 P! H& n4 r% r* d& ^$ E! T1 k
在检测引物的扩增效率时，所用模板是需要稀释的。我们实验室一般是做四个梯度，4倍、4倍的稀释，即：1、1/4、1/16、1/64。

mansnoopy

我们一般是复孔3个，然后整个实验重复三次