关于细胞消化的相关实验操作

huangcong1988

消化时间要视细胞种类，胰酶量等等因素而定，如果细胞是那种贴壁比较紧的，那么消化时间要适当延长，如果细胞贴壁不好，那么消化时间就不要太长，因为胰酶消化时间太长对细胞有损伤，一般情况下消化时间为2~10min，胰酶用量也很关键，一般情况下500~1000微升就行，我养PK细胞，PK细胞比较经得起折腾，我就直接加1毫升，完了消化三分钟，之后再用力吹打，就能使细胞成为单个圆的细胞了，胰酶最好是分装到1.5ml离心管中，大约为0.5~1ml每管就行，用的时候拿一管，其余负20保存

echo

个人的经验，胰酶消化时间长点，相对于不断吹打形成很多泡沫而引起的机械损伤，还是要小些的。

千里草

消化间充质时，个人认为几步比较关键：1 一定用PBS液或生理盐水将取出培养液的平皿再洗一次，去除残留培养基成分，否则会降低胰酶消化效果。2 胰酶浓度，0.25%是最高的，可对半稀释后再用，消化时注意温度，胰酶最后提前在37度预热 3 消化时应在镜下观察，细胞间连接消失时即可弃去胰酶，加入培养基进行吹打。时间太短不容易吹打，太长就过了，影响细胞状态。总之，多实践几次就好了。

POPOLD

利华

yinjiqingqq

回复 突击兵之小土豆 的帖子
# l" U7 p8 N4 F* H. O9 C, u+ E; ^; c1 k& i8 ^
其实对于消化细胞是个细心活，你提到网上说法的多样性，一方面是由于细胞类型的差异：有些干细胞，像MSC类的比较娇贵，细胞消化时间要短且胰酶的浓度要低些；像上皮样细胞，贴壁能力比较强，消化时间室温下要长些，但一般不会超过5min，0.25%胰酶浓度足矣，镜下观察细胞回缩变圆轻轻拍打瓶身，大部分细胞有飘起就可以中止消化了。这个要根据你样的细胞生长特性来决定。. R$ a+ E0 R3 O3 L& E- v
至于中和消化液，也是根据消化酶来选择的。我们一般使用胰酶就是用含10%血清培养液中止，也有些实验室使用其他的酶，就用Hank's 或是DPBS稀释。

dragon513

0.25%浓度是最常用的，浓度已经很大了。胰酶消化对细胞损伤挺大，建议显微镜下控制时间，刚开始变圆就开始中和。血清其实也用得不多，很多是加了点保险系数。我一般含10%FBS的培养基1：1中和。冲洗力度和次数均不可太多，挺伤细胞。这些只能多做多总结了，不是绝对的，各种细胞可能也有差异。

1301918986

对于消化过程的控制我觉得还是有经验的成分。首先对于不同的细胞消化液和消化时间可能不同，一般情况下加入消化液后放置于培养箱内，当在镜下观察细胞胞质回缩变圆时就可以终止消化了。我们用0.25%胰酶消化是一般75cm2的培养瓶加3ml消化3min就可以了，然后用含10%的等量培养液终止消化。如果用含有DEDTA的胰酶消化则终止后应尽快离心，因为EDTA用血清终止不了。

clairezy1983

回复 pauldong 的帖子
! ]1 Y) t3 F+ Y  P# C) E* e0 D6 m, ~. s/ f# ]. d! T
对于MSC来说，消化到细胞变圆漂浮起来，已经消化过了，只要细胞之间的丝断掉就可以终止了，否则会有很多死细胞，胰酶的浓度可以自己调整的，我用的浓度是正常的1/5，我觉得变到1/10都可以的。

dongxin

对于消化的问题真的是个经验的活，不同细胞消化后呈现的状态也不太相同。一定要一边消化（一般都会放置于37度、5%CO2的培养箱中若干分钟，依细胞的不同而不同），一边在镜下观察，如MEF一般胞质回缩、细胞间隙增大 ，即认为消化完全，终止消化；hESc则是在观察到克隆边缘透亮并卷起，即消化完成。
9 i+ Z  J9 p$ @, ^此外，在消化完成后的吹打，一定要注意不要产生气泡，缓慢吸取，向外吹时要在枪头中留有少部分液体，这样可避免气泡的产生，也不影响镜下观察！
7 ^% q& l8 z2 a; T% Y0 p' d再次，胰酶的存放条件，别反复冻融，可以分装到小的离心管中冻存，用时置于4度，但合理安排实验，尽快用完！& S6 [8 L5 H* B1 ^
祝好运！              

pauldong

消化时可在镜下观察，大部分细胞变圆漂浮起来即可终止，终止时用原培养基即可，培养基中的血清可以抑制胰蛋白酶活性。另外，细胞成团现象不是消化过了，而是消化不完全，就是一群细胞脱壁了，但是细胞之间还互相连接在一起，把细胞团挑出来在镜下观察一下就知道了。最后引用楼上一句话，多养养经验自然就丰富了。