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[请教] 关于细胞消化的相关实验操作   [复制链接]

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优秀会员 金话筒

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发表于 2011-9-19 16:50 |只看该作者
消化时间要视细胞种类,胰酶量等等因素而定,如果细胞是那种贴壁比较紧的,那么消化时间要适当延长,如果细胞贴壁不好,那么消化时间就不要太长,因为胰酶消化时间太长对细胞有损伤,一般情况下消化时间为2~10min,胰酶用量也很关键,一般情况下500~1000微升就行,我养PK细胞,PK细胞比较经得起折腾,我就直接加1毫升,完了消化三分钟,之后再用力吹打,就能使细胞成为单个圆的细胞了,胰酶最好是分装到1.5ml离心管中,大约为0.5~1ml每管就行,用的时候拿一管,其余负20保存
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发表于 2011-8-24 12:10 |只看该作者
个人的经验,胰酶消化时间长点,相对于不断吹打形成很多泡沫而引起的机械损伤,还是要小些的。
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发表于 2011-8-22 18:51 |只看该作者
消化间充质时,个人认为几步比较关键:1 一定用PBS液或生理盐水将取出培养液的平皿再洗一次,去除残留培养基成分,否则会降低胰酶消化效果。2 胰酶浓度,0.25%是最高的,可对半稀释后再用,消化时注意温度,胰酶最后提前在37度预热 3 消化时应在镜下观察,细胞间连接消失时即可弃去胰酶,加入培养基进行吹打。时间太短不容易吹打,太长就过了,影响细胞状态。总之,多实践几次就好了。
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发表于 2011-8-21 21:33 |只看该作者
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利华
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发表于 2011-8-20 16:22 |只看该作者
回复 突击兵之小土豆 的帖子
: N( v5 G: f4 z) S) F& t8 v2 U
; ]# x. H4 `0 b0 y. z' R/ z其实对于消化细胞是个细心活,你提到网上说法的多样性,一方面是由于细胞类型的差异:有些干细胞,像MSC类的比较娇贵,细胞消化时间要短且胰酶的浓度要低些;像上皮样细胞,贴壁能力比较强,消化时间室温下要长些,但一般不会超过5min,0.25%胰酶浓度足矣,镜下观察细胞回缩变圆轻轻拍打瓶身,大部分细胞有飘起就可以中止消化了。这个要根据你样的细胞生长特性来决定。$ X6 q/ }2 t8 V5 n' b  P
至于中和消化液,也是根据消化酶来选择的。我们一般使用胰酶就是用含10%血清培养液中止,也有些实验室使用其他的酶,就用Hank's 或是DPBS稀释。
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发表于 2011-8-20 09:26 |只看该作者
0.25%浓度是最常用的,浓度已经很大了。胰酶消化对细胞损伤挺大,建议显微镜下控制时间,刚开始变圆就开始中和。血清其实也用得不多,很多是加了点保险系数。我一般含10%FBS的培养基1:1中和。冲洗力度和次数均不可太多,挺伤细胞。这些只能多做多总结了,不是绝对的,各种细胞可能也有差异。
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发表于 2011-8-19 15:50 |只看该作者
对于消化过程的控制我觉得还是有经验的成分。首先对于不同的细胞消化液和消化时间可能不同,一般情况下加入消化液后放置于培养箱内,当在镜下观察细胞胞质回缩变圆时就可以终止消化了。我们用0.25%胰酶消化是一般75cm2的培养瓶加3ml消化3min就可以了,然后用含10%的等量培养液终止消化。如果用含有DEDTA的胰酶消化则终止后应尽快离心,因为EDTA用血清终止不了。
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发表于 2011-8-18 16:23 |只看该作者
回复 pauldong 的帖子' }8 ~. P; x! C4 O

8 t  u# n6 c- P  P; l! n对于MSC来说,消化到细胞变圆漂浮起来,已经消化过了,只要细胞之间的丝断掉就可以终止了,否则会有很多死细胞,胰酶的浓度可以自己调整的,我用的浓度是正常的1/5,我觉得变到1/10都可以的。
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地板
发表于 2011-8-18 09:26 |只看该作者
对于消化的问题真的是个经验的活,不同细胞消化后呈现的状态也不太相同。一定要一边消化(一般都会放置于37度、5%CO2的培养箱中若干分钟,依细胞的不同而不同),一边在镜下观察,如MEF一般胞质回缩、细胞间隙增大 ,即认为消化完全,终止消化;hESc则是在观察到克隆边缘透亮并卷起,即消化完成。
5 }$ Q+ U* K! F此外,在消化完成后的吹打,一定要注意不要产生气泡,缓慢吸取,向外吹时要在枪头中留有少部分液体,这样可避免气泡的产生,也不影响镜下观察!! ?6 ]/ ~0 {( B' U" k" `
再次,胰酶的存放条件,别反复冻融,可以分装到小的离心管中冻存,用时置于4度,但合理安排实验,尽快用完!
) {) I% b+ a6 ~祝好运!              
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报纸
发表于 2011-8-18 08:13 |只看该作者
消化时可在镜下观察,大部分细胞变圆漂浮起来即可终止,终止时用原培养基即可,培养基中的血清可以抑制胰蛋白酶活性。另外,细胞成团现象不是消化过了,而是消化不完全,就是一群细胞脱壁了,但是细胞之间还互相连接在一起,把细胞团挑出来在镜下观察一下就知道了。最后引用楼上一句话,多养养经验自然就丰富了。
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