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[请教] 关于细胞消化的相关实验操作  

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发表于 2011-8-17 16:05 |显示全部帖子
最近做实验,在细胞消化的过程中,发现自己对于其机理和反应的相关条件不是很清楚,上网查资料众说纷纭。主要是对于胰蛋白酶消化干细胞的过程,简单点说,就是用胰蛋白酶加入长满细胞的克氏瓶中(已提前吸取,弃掉培养液),来回摇动,使胰蛋白酶铺平培养面。是不是只要铺平了,细胞就在消化中,不用反复继续摇动?胰蛋白酶的消化能力有那么强吗?才0.25%啊。2 S+ Y( ^% ~# ~9 C% l
. P0 B& ^# N. o) L  ^
除此之外,中和消化许多人采用血清或者是HANKS‘液,其后也需来回摇动,使其与培养面均有所接触。对于血清和胰蛋白酶的比例,网上也各有说法,麻烦各位战友能不能说说各个说法的原因。反正我们是用10%。
$ x8 i+ F8 d& c% A' d7 ]' Z9 X0 ?! h  m: x. H! N( G
最后,对培养面先用混合液(胰蛋白酶和血清)对培养面进行吹打,后用PBS或者HANKS’液进行多次吹打,我是新手,对于吹打有些顾虑和疑问?忘战友指教。个人认为用混合液时,由于细胞已经被作用消化过了,随便吹几下就行,然后用PBS或者HANKS'液进行仔细吹打,对于吹打的次数和力度,还有时间总是掌握不好,时间长了,怕细胞损失多,力度大了怕细胞机械损失大。用一句话解释啊,哥成了一个矛盾体啊,晕。忘广大战友赐教。
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发表于 2011-8-17 16:10 |显示全部帖子
还有一个题外问题,那就是有一次,细胞处理的有点多,发现消化时有一些白色团块,师傅说是消化过了,经过吹打以后,可以打散。
, J/ Q: F7 e7 |# K( R9 j$ ?
: R9 B2 v+ u/ q- J, U# @4 q- M( D0 d( r! W由此,想多嘴问一句,要是一直用胰蛋白酶消化,让细胞都消化成团块,吹打不就省力了吗,但是人家说消化成团块后,对细胞很不好。但是你想想,回头离心后,吹散,细胞不也是悬浮状态吗,也是分离的,感觉没啥区别。% t) g7 g7 X% x6 d. }# N- Z

/ n' U# n8 G+ J希望大家指正我的各种错误想法!
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发表于 2011-8-17 16:22 |显示全部帖子
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胰酶消化的程度是一个关键:消化过度则对细胞的活性损伤较大,并有部分细胞漂浮,随弃去的胰酶流失;消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性。 影响消化速度的因素较多,主要有胰酶溶液的活性(配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等)、消化时的温度(气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度)以及所加胰酶溶液的多少等 。以笔者的经验,以轻吹或加培养液后轻摇可下较好,但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。5 ~; D8 _1 A! r4 f% @

$ Q9 ]- c% U+ ~" E+ q& R3 p一般的细胞都是由梭型消化成椭圆型时终止消化,如果你消化的过了,你认为会怎么样?就像人一样,可以修指甲,但是如果你把皮剥了呢?
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发表于 2011-8-17 20:25 |显示全部帖子
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我刚开始也纠结于这些,现在根本不管那么多。。。多养养自然就好了

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发表于 2011-8-18 08:13 |显示全部帖子
消化时可在镜下观察,大部分细胞变圆漂浮起来即可终止,终止时用原培养基即可,培养基中的血清可以抑制胰蛋白酶活性。另外,细胞成团现象不是消化过了,而是消化不完全,就是一群细胞脱壁了,但是细胞之间还互相连接在一起,把细胞团挑出来在镜下观察一下就知道了。最后引用楼上一句话,多养养经验自然就丰富了。
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发表于 2011-8-18 09:26 |显示全部帖子
对于消化的问题真的是个经验的活,不同细胞消化后呈现的状态也不太相同。一定要一边消化(一般都会放置于37度、5%CO2的培养箱中若干分钟,依细胞的不同而不同),一边在镜下观察,如MEF一般胞质回缩、细胞间隙增大 ,即认为消化完全,终止消化;hESc则是在观察到克隆边缘透亮并卷起,即消化完成。
2 N7 @+ s( u2 _+ V此外,在消化完成后的吹打,一定要注意不要产生气泡,缓慢吸取,向外吹时要在枪头中留有少部分液体,这样可避免气泡的产生,也不影响镜下观察!/ b  Q# U6 L/ Q4 E' B
再次,胰酶的存放条件,别反复冻融,可以分装到小的离心管中冻存,用时置于4度,但合理安排实验,尽快用完!: S7 @# L8 S; E& `; C
祝好运!              
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发表于 2011-8-18 16:23 |显示全部帖子
回复 pauldong 的帖子( K) G8 }3 q" |

% O+ x# o( h, ?4 o1 [; i3 x对于MSC来说,消化到细胞变圆漂浮起来,已经消化过了,只要细胞之间的丝断掉就可以终止了,否则会有很多死细胞,胰酶的浓度可以自己调整的,我用的浓度是正常的1/5,我觉得变到1/10都可以的。
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发表于 2011-8-19 15:50 |显示全部帖子
对于消化过程的控制我觉得还是有经验的成分。首先对于不同的细胞消化液和消化时间可能不同,一般情况下加入消化液后放置于培养箱内,当在镜下观察细胞胞质回缩变圆时就可以终止消化了。我们用0.25%胰酶消化是一般75cm2的培养瓶加3ml消化3min就可以了,然后用含10%的等量培养液终止消化。如果用含有DEDTA的胰酶消化则终止后应尽快离心,因为EDTA用血清终止不了。
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发表于 2011-8-20 09:26 |显示全部帖子
0.25%浓度是最常用的,浓度已经很大了。胰酶消化对细胞损伤挺大,建议显微镜下控制时间,刚开始变圆就开始中和。血清其实也用得不多,很多是加了点保险系数。我一般含10%FBS的培养基1:1中和。冲洗力度和次数均不可太多,挺伤细胞。这些只能多做多总结了,不是绝对的,各种细胞可能也有差异。
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发表于 2011-8-20 16:22 |显示全部帖子
回复 突击兵之小土豆 的帖子) e! U& Q5 _) v1 x( Z1 L3 C0 ~$ r

$ D1 V6 S6 m* x9 `其实对于消化细胞是个细心活,你提到网上说法的多样性,一方面是由于细胞类型的差异:有些干细胞,像MSC类的比较娇贵,细胞消化时间要短且胰酶的浓度要低些;像上皮样细胞,贴壁能力比较强,消化时间室温下要长些,但一般不会超过5min,0.25%胰酶浓度足矣,镜下观察细胞回缩变圆轻轻拍打瓶身,大部分细胞有飘起就可以中止消化了。这个要根据你样的细胞生长特性来决定。; C& w$ Y0 X1 {2 Y
至于中和消化液,也是根据消化酶来选择的。我们一般使用胰酶就是用含10%血清培养液中止,也有些实验室使用其他的酶,就用Hank's 或是DPBS稀释。
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