关于细胞消化的相关实验操作

突击兵之小土豆

最近做实验，在细胞消化的过程中，发现自己对于其机理和反应的相关条件不是很清楚，上网查资料众说纷纭。主要是对于胰蛋白酶消化干细胞的过程，简单点说，就是用胰蛋白酶加入长满细胞的克氏瓶中（已提前吸取，弃掉培养液），来回摇动，使胰蛋白酶铺平培养面。是不是只要铺平了，细胞就在消化中，不用反复继续摇动？胰蛋白酶的消化能力有那么强吗？才0.25%啊。6 A: t, s5 [; M$ r
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除此之外，中和消化许多人采用血清或者是HANKS‘液，其后也需来回摇动，使其与培养面均有所接触。对于血清和胰蛋白酶的比例，网上也各有说法，麻烦各位战友能不能说说各个说法的原因。反正我们是用10%。
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最后，对培养面先用混合液（胰蛋白酶和血清）对培养面进行吹打，后用PBS或者HANKS’液进行多次吹打，我是新手，对于吹打有些顾虑和疑问？忘战友指教。个人认为用混合液时，由于细胞已经被作用消化过了，随便吹几下就行，然后用PBS或者HANKS'液进行仔细吹打，对于吹打的次数和力度，还有时间总是掌握不好，时间长了，怕细胞损失多，力度大了怕细胞机械损失大。用一句话解释啊，哥成了一个矛盾体啊，晕。忘广大战友赐教。

突击兵之小土豆

还有一个题外问题，那就是有一次，细胞处理的有点多，发现消化时有一些白色团块，师傅说是消化过了，经过吹打以后，可以打散。2 ~  ?) x6 @# S* n; {$ R

/ K; E* E% I- ^" |. q4 B4 g* l由此，想多嘴问一句，要是一直用胰蛋白酶消化，让细胞都消化成团块，吹打不就省力了吗，但是人家说消化成团块后，对细胞很不好。但是你想想，回头离心后，吹散，细胞不也是悬浮状态吗，也是分离的，感觉没啥区别。* l  Q) l! D; }% r$ l
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希望大家指正我的各种错误想法！

rain2402

胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。 影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 。以笔者的经验，以轻吹或加培养液后轻摇可下较好，但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。
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一般的细胞都是由梭型消化成椭圆型时终止消化，如果你消化的过了，你认为会怎么样？就像人一样，可以修指甲，但是如果你把皮剥了呢？

baffle

我刚开始也纠结于这些，现在根本不管那么多。。。多养养自然就好了

pauldong

消化时可在镜下观察，大部分细胞变圆漂浮起来即可终止，终止时用原培养基即可，培养基中的血清可以抑制胰蛋白酶活性。另外，细胞成团现象不是消化过了，而是消化不完全，就是一群细胞脱壁了，但是细胞之间还互相连接在一起，把细胞团挑出来在镜下观察一下就知道了。最后引用楼上一句话，多养养经验自然就丰富了。

dongxin

对于消化的问题真的是个经验的活，不同细胞消化后呈现的状态也不太相同。一定要一边消化（一般都会放置于37度、5%CO2的培养箱中若干分钟，依细胞的不同而不同），一边在镜下观察，如MEF一般胞质回缩、细胞间隙增大 ，即认为消化完全，终止消化；hESc则是在观察到克隆边缘透亮并卷起，即消化完成。
8 R4 a0 p2 q- O6 T* E) w- z此外，在消化完成后的吹打，一定要注意不要产生气泡，缓慢吸取，向外吹时要在枪头中留有少部分液体，这样可避免气泡的产生，也不影响镜下观察！
! `% J  @0 r# n& b/ z3 [再次，胰酶的存放条件，别反复冻融，可以分装到小的离心管中冻存，用时置于4度，但合理安排实验，尽快用完！
4 _$ d# v0 N8 e$ E祝好运！              

clairezy1983

回复 pauldong 的帖子2 d' m3 f+ r* L) W* {4 ]. O9 `
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对于MSC来说，消化到细胞变圆漂浮起来，已经消化过了，只要细胞之间的丝断掉就可以终止了，否则会有很多死细胞，胰酶的浓度可以自己调整的，我用的浓度是正常的1/5，我觉得变到1/10都可以的。

1301918986

对于消化过程的控制我觉得还是有经验的成分。首先对于不同的细胞消化液和消化时间可能不同，一般情况下加入消化液后放置于培养箱内，当在镜下观察细胞胞质回缩变圆时就可以终止消化了。我们用0.25%胰酶消化是一般75cm2的培养瓶加3ml消化3min就可以了，然后用含10%的等量培养液终止消化。如果用含有DEDTA的胰酶消化则终止后应尽快离心，因为EDTA用血清终止不了。

dragon513

0.25%浓度是最常用的，浓度已经很大了。胰酶消化对细胞损伤挺大，建议显微镜下控制时间，刚开始变圆就开始中和。血清其实也用得不多，很多是加了点保险系数。我一般含10%FBS的培养基1：1中和。冲洗力度和次数均不可太多，挺伤细胞。这些只能多做多总结了，不是绝对的，各种细胞可能也有差异。

yinjiqingqq

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其实对于消化细胞是个细心活，你提到网上说法的多样性，一方面是由于细胞类型的差异：有些干细胞，像MSC类的比较娇贵，细胞消化时间要短且胰酶的浓度要低些；像上皮样细胞，贴壁能力比较强，消化时间室温下要长些，但一般不会超过5min，0.25%胰酶浓度足矣，镜下观察细胞回缩变圆轻轻拍打瓶身，大部分细胞有飘起就可以中止消化了。这个要根据你样的细胞生长特性来决定。  S' I, r2 C) q6 z, }& @5 ~7 b1 D# d- |
至于中和消化液，也是根据消化酶来选择的。我们一般使用胰酶就是用含10%血清培养液中止，也有些实验室使用其他的酶，就用Hank's 或是DPBS稀释。