关于细胞消化的相关实验操作

细胞海洋

回复 gaojingyu0311 的帖子
6 b; V- N& J" k6 {- P1 p3 ]/ G% S
" b! \& d* t$ t; D# \% J& _1 J建议你发新帖提问

blackhei

最近在养MSC，细胞状态不是很好，第二代的细胞已经老化，胰酶消化时比较困难，贴壁牢固，基本不变形，有极少部分漂浮，消化时间延长则已经漂浮的细胞严重受损，出现两次这样的情况。现在想到的是胰酶消化几分钟，如果消化不下来的话就只能吹打的时候多吹打几次，但吹打的时候动作要轻。

阳光正暖

胰蛋白酶使用注意：9 }! g# \' b3 n* w  O- V
1、在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。
7 b- d* x3 w7 j1 ?; c# l3 @2、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，会对细胞造成损伤，细胞铺板后生长状况会较差。
+ v: x, _* f! n% ? 8 P* M. [. v7 W, o6 h% l7 H
贴壁细胞的消化：
; m; G& |. L& z2 x/ `8 M, x1 v# P1、吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清1 D$ z4 v( M. C9 W& h
2、加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量。室温放置30秒至2分钟（不同的细胞消化时间有所不同）7 O. D5 o- X9 D1 Y
3、显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。# g# n! W" I8 _8 P8 r/ ^& d3 k
4、此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。2 a! I% k3 ^. g) Z4 [: u
如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。
6 q; ^: Y, j1 E" L$ Z常用的细胞消化液为胰蛋白酶（Trypsin），EDTA等，其功能主要是使细胞间的蛋白质（如细胞外基质）水解，改变细胞间的连接，使组织或细胞片分散成单个细胞，制成细胞悬液用于进一步的实验。/ ]) F+ X3 ]) W, `6 Z! ~0 X0 N
影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 。! J5 r/ h6 Z8 s6 F) I+ C
加入胰蛋白酶-EDTA溶液，视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多（依培养器皿的大小而定），以使充分浸润；6 M1 M( L( |2 Z5 x9 j
一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为透明、点状（出现细小空隙）时，弃去细胞消化液，或看见培养瓶壁呈白茫状即可。并加入适量的完全培养液终止消化，吹打分散；如见大量细胞片状脱落，已消化过头，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作。（消化过头，可造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成细胞破碎。由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂，所以加入完全培养基可以终止反应。
7 ^4 T* F% O5 c; z! K
6 X( c3 v! ~; \/ m) y胰酶配置方法：4 W  i# [3 }( Q( q) L
1、培养液配制，方便好用，对细胞影响小，并且培养液的ph值正好适合胰蛋白酶的溶解
5 n, e& o% W) d/ M2、生理盐水配制，要先调ph值7.2到7.4（①胰酶（1：250） 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力搅拌2-3小时，调pH 7.8-8.0，过滤除菌。）
3 ?# R/ a, Y* [" D* p3、pbs（0.1%胰酶溶液的配制：称取胰酶粉末0.1g，先用少许灭菌过的PBS调成糊状，然后补足到100ml。置室温搅拌4小时或冰箱内过夜，过滤灭菌，分装，4℃保存备用。）; 或是hanks或是D-hanks液配制（1.称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许D-Hanks 平衡盐溶液（pH7.2 左右）调成糊状，然后再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，并不断搅拌振荡；2.次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0.25% 或0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右。）8 m- Z0 Y7 X8 v) W1 U) t
一般0.45微米的一次性滤器过滤除菌，至于作用效果，需要消化一次细胞感觉一下，因为不同厂家的酶不一样，有的作用温和，有的作用剧烈。
' ?3 ^6 A8 d+ Z4、是否需要四度放置过夜，取决于你的胰酶的纯度。过去的胰酶纯度不高，所以难以溶解，需要四度过夜. 而现在的胰酶纯度都很高，就没有必要四度过夜。从理论上来说，四度放置过夜，给细菌生长的机会，尽管过滤可以出去细菌，可是出不掉其代谢产物。
& n. J& C) C* E' x0 \/ B' f ( B! \* [3 V/ [0 D0 i0 k. `0 G/ b
胰蛋白酶不溶,有絮状物的原因，考虑有：: F* d5 I) a1 H& o) H1 b- l
1、过期或是酶已经部分变性
2 C) t' M. a+ B* I2、溶液ph值不对
; D! u7 L. {0 f) V3 T3、在没过滤之前的絮状沉淀是正常现象，因胰酶多取自动物胰腺，沉淀为组织块，过滤后即可