请教迅速高效分离卵母细胞的方法

moluxingke

由于实验需要，打算从刚出生不久的小鼠（PD3-PD14）卵巢中分离卵母细胞，向大家请教一下分离方法，下面是我看文献整理的一些步骤，感觉所需时间较长，大家有没有其他的更为有效的方法？望不吝赐教，谢谢。
* h5 E1 V% \: F: x6 M& T% ?; Y2 X4 q- W+ X% Z( y+ z6 T0 B* N5 s
1 小鼠脱颈处死，取出卵巢，在显微镜下剔除脂肪垫和多余组织。! e- w0 B+ t( \- c- O% M# ~1 Q
2 将卵巢剪碎，然后胶原酶消化，消化过程中不断吹打振动。
/ d6 k- z4 q7 H9 k2 R6 P! t  胶原酶溶于DMEM/F12培养基中，浓度为0.05%，培养基添加0.4%（g/ml）的BSA，100U/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素，
& A2 {4 C- P2 P# M8 E5 l5 N" ?3 大约40-60min以后，待组织消化基本完全，往消化液中加入EDTA至终浓度为40mM，然后于37℃孵育15-20min，期间不时搅拌，直到颗粒细胞以及其他细胞类型完全散开。
4 R7 m$ y' n: A6 n0 e4 将细胞混合液洗涤一次，然后于上述不加血清的DMEM/F12培养基中培养12h，使颗粒细胞和其他细胞贴壁生长，未贴壁的卵母细胞和血细胞被聚集到上清液中，室温1000rpm离心5min，然后血红细胞经过低渗buffer出去，（含144mM NH4Cl和17Mm Tris-HCl Ph=7.2）。
& S( O" x6 D, L9 t5 `- H/ I2 J' R5 洗涤几遍以后，离心收集卵母细胞，加入裂解液裂解后，14 000rpm 离心20min，4℃，取上清测BCA法蛋白浓度，待用。5 J- T3 z) r* @6 d6 O( M

# t' O. g/ S+ q. m        具体方法参见：   Pradeep Reddy, et al.  Science，2008# {: A+ i9 q4 ]. o. `

echowdk

哦，那再看看其他人有没有更好的办法提供给你吧。

moluxingke

回复 echowdk 的帖子
9 u$ `- @4 S7 t# \' j
( S, c  Y$ Z" q2 X' |嗯，谢谢，不过我有时候需要的是一些较为早期的卵母细胞，比如原始卵泡库刚刚建立或是次级卵泡之前的阶段，那个时候卵泡对激素的应答能力还比较低，呵呵，感谢你的帮助。

echowdk

我们一般是让小鼠超排卵，这样的话在小鼠卵巢的壶腹部就可以很明显地观察到一团云朵状的卵细胞。然后……
2 e$ X: D: j" I7 |: L& m" Q1. 在体视镜下，用注射器将壶腹部挑破，云朵状物质就自然流出来了。1 s1 o3 i1 o* v3 h
2. 再用piepet（20-200ul的）将其整个转移到透明质酸酶（50ul)中消化大概30s，这样卵细胞就都散开了。# C) ?2 N: e5 {/ d9 I8 g
3. 用mouth piepet 将这些卵吸到HK（一种胚胎培养液）中中和，然后再洗3-4次就可以了。