大家包装的慢病毒滴度是多少（不包括浓缩）

salomemao

回复 ying 的帖子3 j3 d6 a( J& I+ X* a( M1 u$ z
; |2 \+ l9 Z2 g8 s" ?
你们平时养细胞的时候都是加双抗的吗？

ying

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: ~6 _" T* z, k8 c
5 {1 L" j# k( v) ?; R& a转染三质粒的时候，我们实验室的protocol是不加双抗的，据说双抗会影响我们的体系的转染效率。原因我也不知道。之后十二小时后我们认为质粒已经进到细胞里面了，所以再加上双抗防止污染。

ying

回复 huangcong1988 的帖子5 G. L+ k5 J: r5 F) E: m+ u
9 Z1 s8 i" X) f- R; u
按这样说来，确实是被稀释了。
+ M6 c* H# P& ~' W" _不过，通常我是这样认为的:# n' w2 I# \4 W: u7 _2 j
一开始没浓缩时，假设体积是100毫升，
9 c' j% F) E4 G$ V; O# o浓缩后，变成一个坨坨，( `3 S" J$ [/ |- S& i
把这个坨坨用1毫升的溶液给溶解了，
$ q+ A$ d( d; B+ C( [假设病毒没有损失率，那么就算是“浓缩”了100倍。因此用我的观点看，是“浓缩”了。

huangcong1988

回复 ying 的帖子5 }% j* Y2 U8 p. p& H! y$ u2 Q
2 o+ ^' E9 m! a' S  j
不是，我的意思是说，在你浓缩完病毒后，倒掉上清，底下沉淀里面加新鲜培养基，加了培养基之后把沉淀吹打混匀，然后再用来感染细胞，可能我没有表述清楚吧，我是说，加了培养基后，病毒不就被稀释了么？

salomemao

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/ V3 L$ {3 f3 }  X
! t2 y" R( R9 l! C弱弱的问一句，为什么要在12小时后加入双抗的培养基呢？是你们本来养细胞的时候就是用双抗的培养基，还是转染后这样加的呢？谢谢

ying

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: |; D. g. m0 @9 s1 K. h# F9 l: i/ C; v
浓缩后加的培养基可以是你转染的对象细胞的培养基呀。如果你足够猛，就直接把这种浓缩过的东东当作培养液加到吸走培液的细胞里，那就浓到了极限了吧～

huangcong1988

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, O. \1 Z7 }9 p4 p8 }5 m& c9 F0 P6 X8 Y7 Y' W9 b
我的也是差不多10的6，浓缩后差不多浓缩100倍，但是浓缩后还要加入一定体积的培养基啊，这样不是等于又把病毒给稀释了么？

sj03572001

回复 ying 的帖子# K9 O  M! k! F! O% p
  C0 e. G5 e: Q
谢谢，我们的系统不一样，不过你的建议很有用哦

ying

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7 H: ~& P- I0 o% z
' R2 G9 W/ R$ ?* {' I8 n! |! l我是VSVG, delta-R8.91 和pGIPZ三质粒系统。我不知道是不是invitrogen的，因为是从我们实验室别人那里要的体系。protocol不方便给你原版，因为是别人整理的。但我可以说个大概。就是，用10cm dish 满的293T一盘传4盘（10ml培液），这4盘都不加双抗，培养24小时，大概达到50-80%覆盖率。这时候做个类似于lipo2000的转染，按标准的lipo的protocol转。就是一只管子加optiMEM和lipo，一只管子加potiMEM和质粒（VSVG:R8.91:pGIPZ=1ug:3ug:4ug，对于10cm大盘），之后混合，放置15分钟，再滴加到细胞里。12小时后换液换成有双抗的培液（DMEM加10%血清），之后36小时收一次病毒，再换液，再24小时后收一次。大致流程就这样。我觉得最关键的就是转染效率，建议你用个GFP的质粒先摸转染条件，主要就是lipo加多少，质粒加多少。效率要90%以上GFP阳性才行。
3 [3 K" i# A5 o- a0 Z如果你包装的是shRNA或者miRNA的序列，这种病毒滴度本来就不容易做的高，因为有些RNA自己会被切断，而没法包装成病毒。只有幸存的RNA才会包到病毒里。
: i+ `1 s% m. f, A* F祝顺利！

sj03572001

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- o* z6 k3 x# I) ^
0 ]3 z0 {# I3 P+ |. C' r你好，我之前包的病毒滴度总是很低，我们实验室以前没有师兄师姐做过，我刚开始尝试，不知您能发给我一份你的Protocol 吗？我们实验室用的是Invitrogen的系统（PL1，PL2，PL-VSVG)