贡献详细磷酸钙转染法试剂配制过程

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酸钙转染法
8 i1 ]" Z# [8 W  _材料：/ S+ F, u8 o) o
质粒DNA
! F( p7 @: w4 T5 H' S; m1 Z指数生长的真核细胞% Z* \7 J/ O0 ^  N; U* X  b
2 M CaCl2
" Q* w6 T1 M$ D# N; m2×HBS （pH 7.05）8 o9 z! L: w1 Z. r1 F1 @
配方:7 T  D% a2 @( A
2×HBS (pH7.05)：900 ml 超纯水中加入NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214g，Glucose 2.4 g和 HEPES 10 g，调pH至7.05，定容至1 升，过滤（0.2μm 滤膜）后储存于4℃备用。
7 G' f. w+ M2 |方法：
! A# I) U# L7 k$ I8 q- ~' @1. 细胞分盘： 通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以 1×105至 4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于 60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的 40~70％） 。将细胞置于含 5％CO2的37℃温箱中孵育8~24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。 转染前2 h换液（用4 ml 新鲜的完全培养基置换旧的培养基） 。2 E. o$ A& b0 {( o
注：为得到较高的转染效率，尽量使用指数生长的细胞，转染时细胞的密度不超过80％。+ o; [, D0 V7 [( t- A
2. 制备磷酸钙－DNA 沉淀：以60 mm 组织培养皿用500μl 反应总体积为例。在灭菌水中加入质粒DNA（总量4~10μg为佳），再加入31 μl 2 M CaCl2，使三者总体积达到250 μl，混匀。将等体积 2×HBS 盐溶液逐滴加入，同时轻弹管壁，使每滴加入后及时混匀。静置 2 min 后，立即将这500 μl 的磷酸钙－DNA悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。0 A0 M) n; t& d3 P6 `+ |- O
注： 可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色， 应尽快将其混匀，避免形成过大的颗粒，影响转染效率。
* @, b! Q3 b2 I* v  r6 `6 P5 u+ z; x! ?+ w7 H5 ?% C  @
其中的关键是HBS的PH值，有人说6.8-6.9也行。
# }2 y4 Y- ?' b* u0 x以上方法供大家参考。

细胞海洋

注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色，应尽快将其混匀，1 i4 v2 u* W5 {, m
避免形成过大的颗粒，影响转染效率。
$ n  n7 Q' L' f5 r3．若转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5％ CO2 的37℃温箱孵育。8 h/ c) n! v/ G; b' A
后吸去培养基与DNA 沉淀，加入5 ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放; `6 _3 x6 C6 d+ c
置温箱孵育，16-40 h 观察其转染效率。" N: B0 f- G) I; U
参考：分子克隆实验指南第三版（p1284～1285）8 A' g3 \  o2 j8 P) E0 A