Trizol提取RNA比值偏低

dmmwhb

最近用上海生工的Trizol提取总RNA，按照说明书一步一步来都做好几遍了% E' I. w! {/ N  y  Q$ J
最后测得的比值都在1.3-1.4，很不好0 q) e0 s* M# D. o% u+ v3 O* t
最后一步我是室温干燥5min，加30ulDEPC水吹打几下就测0D值了，这步有问题吗？要不要等一段时间让RNA溶解？
* J! z, N# v! p$ o+ u请高人指点问题可能处在哪里？

dmmwhb

回复 ilovelife 的帖子" n  h- O8 [, `8 f5 K( @$ G8 s' e

4 d3 Y. C$ r: x7 q非常感谢ilove的建议

ilovelife

同意dahui 的建议。大概3点建议：5 F4 J3 [7 i8 y
1. 可以用75%乙醇洗两次，量用的大一些，上下颠倒几次，目的是把残留在管壁和RNA沉淀表面的盐去掉。最后一步去掉75%乙醇后，稍加离心，用10ul枪头吸去微量残液，室温晾干时切忌量得太干，否则及难容，观察到确实没有液体了，从最边缘开始有开始变白的迹象就加水溶解。6 j( w8 r3 p; a) `' ?4 t0 S
2.换一批Trizol，氯仿和异丙醇试试，可以先从其他有成功经验的实验室借，用来做对比试验，一次替换一个对比元素，这样容易找原因。
, `, a9 u! i" y# x8 v4 T: J# I6 V3.跑个电泳看RNA是否降解。7 s+ S8 D' [4 ]1 k; w4 B
祝你很快解决这个问题。

dmmwhb

回复 xiaoyurly 的帖子, q; y0 M8 \* N9 j9 A0 ]
- A) j3 L! w9 r0 \7 L1 ?
先谢谢你的回复，说明书上说的只晾5-10min，久了不容易溶解，还有就是在室温久了容易降解啊，不过我没试过这个，下次还是试试晾干久一点

xiaoyurly

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' `. a0 i7 ?$ a  I- \' J1 [' e  O  Z( l/ N  F
乙醇洗涤后挥发的时间太短了吧，没挥发干净会影响RNA质量的。我们一般都是尽量吸净乙醇残液，甚至用干净的吸水纸吸干，觅一个僻静之地室温挥发15min左右。溶解RNA时60-70°水浴助溶。

cronos0910

75% 乙醇那步没做好, 比值才会那么低, 回溶的步骤我建议在4度10mins

827914734

我认为比值低应该还是污染，吸上清时不仅要注意不要吸到中间层，而且尽量不要重复吸，只吸一次就可。. n4 @5 j8 I% A& J' A  a1 T7 w
另外，干燥时间较短，我一般都20分钟左右，加DEPC水后，不需要等太长时间

langziforever

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( v" j6 E' J, k3 m. v8 X- ^
$ Z+ m- b) `( l* h6 }那就取决于你RNA的浓度了！把它稀释到你测量仪器的范围内就可以了，我一般会稀释稀释过50倍、100倍、200倍，然后终浓度在10ug/ml左右比较好！但主要还是看你测量仪器的精确范围了！太浓了会使操作时的误差增大，而且损失样品，太稀了测不准，受杂志影响很大！

wangzhiqi86

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' W% {, `: H" b1 h; \0 ^; n/ x3 S9 b/ f
这么短的时间是不会的，我经常这样，测出来的A260/A280不会超过2，大概1.8左右吧！

dahui

回复 dmmwhb 的帖子2 X/ [. K8 J0 y9 ?: u7 o" q% a
5 g6 g) z2 r, h, @9 _" t$ Q
大哥，这几个东西好像都不贵吧，除了氯仿是管制的意外，其他的都好买呀，一年多了？我劝您还是换一下吧，另外如果是别人用剩的就更要换了，我们通常都是抽提RNA的有自己一套东西和试剂，从来不和其他实验交叉使用