Trizol提取RNA比值偏低

dmmwhb

最近用上海生工的Trizol提取总RNA，按照说明书一步一步来都做好几遍了
" n- W4 {3 C* t. w- [' @最后测得的比值都在1.3-1.4，很不好
6 L" G: e. g! }- }6 Q1 v最后一步我是室温干燥5min，加30ulDEPC水吹打几下就测0D值了，这步有问题吗？要不要等一段时间让RNA溶解？
+ C8 s# m/ {- `7 s' W请高人指点问题可能处在哪里？

wangzhiqi86

我有很多次测的也是1.3-1.4，也能做的，只是不纯而已。加DEPC水溶解的时候，里面可以加一点RNA Inhibitor（0.1ul/10ul DEPC水），防止RNA降解。由于RNA是大分子，一般需要室温溶解半个小时之后，也可以4℃溶解过夜（不建议），再测OD。

langziforever

回复 dmmwhb 的帖子. x3 b2 q  g! }2 @, _# N
6 B2 |, j8 E( }% Y" J. v. W
我觉得测的比值低，和你RNA是否完全溶解没有太大关系，主要还是有其他的污染，如果是260/280说明可能有蛋白质的残留，如果260/230的话就是盐离子或多糖这些的残留，所以，估计原因还是在于你前面的操作步骤，TriZol是不是量足够，后续的抽提步骤是不是彻底，每次吸液不要有残留，注意下这些细节。另外，我个人觉得Trizol的质量也很重要，我没有用过生工的，但以前用invitrogen的不同批次提RNA都会有不同的效果，所以，还是建议你注意一下！

dahui

对于这个问题，我也纠结了半年，每次测的260/280比值都不稳定，建议以下几点：9 Q) Q: U, V6 X, r- T
一、从离心管和枪头的灭菌、DEPC水和75%乙醇、氯仿和异丙醇的无菌程度及成品的试剂等级来考虑，做到没有纰漏；
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二、组织样品来源，以及前处理方法及处理过程中的处理，主要就是冷冻的程度与速度决定了内源性RNase讲解RNA问题，另外就是Trizol添加量问题，如果RNA的最终量要求不高，建议组织的量尽量小；* p3 L8 d* H2 ]& c0 L
1 M* [. q+ }7 ]2 Y' Y
三、加完氯仿后颠倒的剧烈程度，以及加完异丙醇后混匀要尽量轻柔(包括加液时的液流速度)，另外更重要的就是吸取上清时不要贪多，建议400微升就可以了，另外就是离心管从离心机拿出时顺着其倾斜的角度取出，不要直立放架子上了，直接上枪吸取；
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四、后面75%乙醇洗涤时可以洗两次，并且弃乙醇时，倾倒上清后再稍离心，用10微升的枪吸取干净，这样可以加快乙醇挥发的速度；
$ _' t" o) G7 h另外，抽取过程中时刻观察离心后管底的RNA状态(一般情况下是可见，透明稍嫌白色)，并且在自己找原因的时候，试剂、耗材，包括操作手法做几个平行对比，RNA干燥时不用太久，注意观察，加DEPC水后，理论上讲是“入口即化”这种，不用等很长时间，但如果沉淀确实多，可以用枪稍作混匀或64读加热助溶。
+ p# R/ u0 c' F, K+ ~4 v8 m3 [
/ k9 p9 u" {: M- b; v2 Z                           ——以上说法与建议仅供参考，欢迎讨论交流。

dahui

再补充一点，建议做一个电泳看看，RNA有没有降解，上样钱，上样的RNA和buffer在60读共孵育10min，为了是考察有没有污染。

zxcv12345

回复 dmmwhb 的帖子7 _, y8 D: U  n2 X
- X  b; m7 j3 Q# q
比值低，主要是蛋白等污染物较多造成的。在取上清时，不要吸取中间层

dmmwhb

回复 dahui 的帖子8 x) Y% x2 X; T6 z( F" {, G$ [
, C2 o1 ~% v1 H' M
非常感谢你回复，我用的氯仿、异丙醇、无水乙醇都有一年多了，这个还能用吗

dmmwhb

回复 langziforever 的帖子4 f  K# u1 n: ?

; a  Y: ?+ \( w0 r/ C$ E6 E% c谢谢，测比值时一般稀释多少倍比较好啊

dmmwhb

回复 wangzhiqi86 的帖子
( Y. {* p( Z) h  y: F. q1 a, N
* ?4 M9 I, v( W4 J% R5 a8 ~% K' w谢谢哈，30min室温溶解RNA会不会降解厉害呀？

dahui

回复 dmmwhb 的帖子
5 F( i$ R( ]8 Z9 X/ l0 T( m: n' _) ~+ e1 Z) E
大哥，这几个东西好像都不贵吧，除了氯仿是管制的意外，其他的都好买呀，一年多了？我劝您还是换一下吧，另外如果是别人用剩的就更要换了，我们通常都是抽提RNA的有自己一套东西和试剂，从来不和其他实验交叉使用