我的小鼠骨髓基质干细胞正常吗？

bathpp2007

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培养小鼠BMSC多日，不太顺利
6 Z! m  Y* c- I, c10月11日取4周c57小鼠三只胫股骨，冲洗物离心接种到25cm瓶中，) p& B% n/ n' Z1 ~, O: N
次日换液，之后隔二日换液，11月2日达90%，0.25%胰酶消化，
6 L" [  m; q# ]1 ~; {无EDTA（上次传代消化液含0.02%EDTA，细胞次日观察几乎全部漂浮），
( ?. k$ ~. [& k5 ~: V' O: f全培养基中和，无离心，直接1:2接种，5小时后观察已贴壁，3日中午观察贴壁良好，
- O; I1 G: ~3 l4 e- Q$ R* G5日观察见基本如下图示，细胞薄，亮，且数量变少约三分之一，下图为今日6日照片。" `5 r' f  c) {7 z  m
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问题：1. 我的细胞是BMSC吗？# I( U4 J( I' @6 h4 [" d
2.为什么会有一次数量的减少，是传代选择吗？（不是BMSC的细胞自然死亡）
/ f; e& Z$ b* l9 @& ]! Z3.图中蓝箭头即是BMSC吗？红箭头指的圆形的是什么东西？
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P1传代后11天了，当时是1传2，共4瓶，目前生长缓慢，选较好的两瓶拍了照，请行家里手给看看7 v! E( x* ^, S# J2 X% e1 B2 o& Q
用的是DMEM/F12，10血清，GIBCO；生长如此慢……样子如此丑619056399
; Q$ h* @6 v; [细胞形态与上次相比有些变化，不是那么典型的“纺锤形”了 * l( b5 G' t1 [" ~3 N0 `1 y; k& j

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5 c; c8 K0 y9 _- y! B0 _, q: B9 s. f/ ^7 m  g! A7 Q

imgaga

低倍镜照的不是很清楚，高倍镜下看细胞不纯，红笔标的是杂细胞，传代时应该可以除掉。细胞数量减少，也许和消化有关，是不是消化时间太长了？在细胞不纯的时候，可以用完全培养基终止消化后，把细胞吹打下来，然后离心，重新种瓶，原来的瓶子可以加培养基再养。个人观点，仅供参考~

bathpp2007

imgaga 发表于 2011-11-15 20:09 3 k. A& O, m8 N0 K* @
低倍镜照的不是很清楚，高倍镜下看细胞不纯，红笔标的是杂细胞，传代时应该可以除掉。细胞数量减少，也许和 ...

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谢谢！) k  `) w2 T3 x; q) j* J
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细胞为什么长得这样慢呢？也和消化过度有关吗？/ |5 F1 J: ?( T3 }9 R4 y
这样的生长，最后得到的还会是骨髓干细胞吗？
, ], t% y& M  ]2 b6 SDMEM/F12应用于BMSC的培养没问题吧？

hnsdlgl

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图中蓝箭头所示应该是BMSC，而红箭头所示可能是未铺开的BMSC或其它杂细胞。% ?" g( M+ C2 h3 B

% o& j! H5 {8 @( R% _' b- l# X从培养过程来看，我个人有几点小经验：
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; i2 Y3 T- L5 T# g1. 换液：首次换液应该在24小时之内，因为这时DMSC已经大部分贴壁，而其它杂细胞还有很多尚未贴壁。然后是3-4天进行一次半量换液。这里需要强调一下，时间是3-4天，换液方式是半量换液，因为细胞自己分泌的生长因子也是细胞自身生长所必需的，你如果换得太频繁，而且进行全量换液，那么你就相当于把细胞好不容易分泌出来的适量的生长因子给丢弃了，而让细胞重新进入一个新的生活环境，这样对细胞的生长事实上是很不利的。; `2 T  [! K$ s) E0 v
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2. 血清浓度：不知道你原代细胞培养用的血清的浓度是多少，建议可以用10-15%之间，因为适当提高血清浓度有利于细胞贴壁和生长，而太高却也会加速细胞老化；传代后的细胞培养时血清浓度建议10%。! S+ f; Z" c% z; u

2 D* Q* V" h5 `! N3. 传代：胰酶消化的时间不要超过5分钟（我个人操作过程中，胰酶消化的时间通常2分钟内完成），胰酶消化传代一定要用血清终止，然后离心（1000g-1左右 离心5min），将胰酶尽可能处理干净。种细胞时，如果细胞是80-90%融合时进行传代，前几次次传代可以1传3（当然这还要视你取细胞的效率，是否绝大部分取下来？细胞损伤是不是不大？），第4-5代以后，基本只能1传2了，因为那时细胞个体变大，且生长能力下降，传稀会导致细胞长不出来。; @/ {: G+ b+ h6 C- M7 d3 p: }

卡门

我之前养的小鼠骨髓干细胞也出现消化后死亡的情况，后来控制好消化时间就好很多了；
0 W/ _$ i, H+ ?此外，你要确定你的细胞是不是干细胞，可以通过流式选几个表面标记进行检测，一般3代以后能达到85%以上。

bathpp2007

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hnsdlgl 发表于 2011-11-15 20:41
; x$ u2 v0 I0 V/ T图中蓝箭头所示应该是BMSC，而红箭头所示可能是未铺开的BMSC或其它杂细胞。
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2 d7 T% j, O) M( d3 A5 X从培养过程来看，我个人有几 ...

5 C1 z$ W7 Q" F* p/ o

; L0 s% ^0 @; }7 i+ _, D$ q, n4 ^谢谢您的热情指导！
) U+ Q: R8 @" Y8 `9 Y( W1.我是24小时换液，也试过8，48，72，感觉差别不大。换液却是全液换的，今天再做次原代，试一下半量换。传代之后就不用一直半量换了吧？
2 Z9 F0 N7 K/ @5 p2 X( a- F1 b2.目前是10%的血清浓度，用过13%的，感觉上还可以，但那次传代后换成10%，细胞全死了，这次原代和传代都是10%。: h+ d" R' c2 \( G5 \7 l  r' b5 R1 {
3.0.25%的胰酶消化了5分钟，没有离心，血清终止后直接传代接种的。4 X+ I/ ]' c: i3 E( w

6 u9 U7 {6 M  `9 \2 p有一次原代传代后不贴壁，细胞都漂起来了，两日后白茫茫大地真干净，是不是也是消化过度，吹打得太厉害了？

bathpp2007

卡门 发表于 2011-11-15 21:09
0 m, ?1 A4 i: M% F$ ?我之前养的小鼠骨髓干细胞也出现消化后死亡的情况，后来控制好消化时间就好很多了；
+ v. Z5 L% ?' h% W2 a2 A此外，你要确定你的细 ...

0 R( E3 l: k1 ]: Y! O8 R/ }似乎我的细胞死亡的原因就是消化时间长了" j0 E8 c( z, r1 ~. J% x
本次传代没有用EDTA，也没有离心，以为可以尽量减少细胞的损伤。! y/ k/ N; K: q  z6 r

1 d9 N2 P* O# UP1代已经十多天了（后面三张图），生长如此慢的原因也是由于消化损伤么？

hnsdlgl

. o% x$ z1 j* D- v: r) a$ Z

bathpp2007 发表于 2011-11-16 09:55 " C# G+ T8 D5 L+ V2 _
谢谢您的热情指导！
/ g4 g/ Q7 {) r, C% y1.我是24小时换液，也试过8，48，72，感觉差别不大。换液却是全液换的，今天再做次 ...

2 }( L, t# Q; t% A+ j5 g* [( u% p" N" W
是原代细胞种下后24小时左右换液，保证大部分MSC贴壁，而不让内皮细胞贴壁，因为内皮贴壁时间通常在36-72h，而内皮的生长速率比msc快，然后3-4天进行半量换液。（也就是说，我习惯换液用半量方式，传代采用全量）  ^1 }7 R  O4 S: j* _, s6 _% i
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传代后细胞可以不半量换液，不过，要注意种密一点，不然也不容易长出来。4 s6 a1 m# d6 r) n; [2 N- x
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胰酶一定要去掉，MSC对胰酶很敏感，消化5分钟可能有点长，我常用的75cm培养瓶的消化方法是：吸弃原培养液后，用预热的PBS润洗3遍（要快速），第3遍润洗吸弃PBS时，留大约1mlPBS于培养瓶，然后加入1-1.5ml 含EDTA的0.25%胰酶（我用的是公司生产的胰酶溶液，不是自己配的），放入培养箱60-90s后，取出置显微镜下观察，如果有1半左右已经收圆，立即一手持培养瓶一侧，用另一手掌中等力度拍打培养瓶另一侧，交换拍打，反复几次（整个过程应该是10-20s），立即置于显微镜下观察，摇动一下培养瓶，如90%已在流动，立即加入1ml四季青血清（终止消化用Gibico的太浪费），晃动培养瓶，终止消化，将细胞吸至10ml已灭菌离心管，另往原培养瓶中加入3mlPBS，稍作吸打后也转移至该离心管，充分收集细胞，然后就于25摄氏度，1000g离心5分钟，弃上清，后面的操作就是估算细胞量和种瓶（注意不要种得太稀，MSC通常种得越密长得越快，但种得太密，传代就会太频繁，那也会损伤细胞）。
7 Q3 e# T8 b; i% I$ M
) _- X/ E$ e# m& k5 Y1 n6 a建议不要用吹打的方式，用拍瓶的方式力量较均匀，细胞受损较小
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wanglijing2011

回复 hnsdlgl 的帖子# t8 k2 i* B% v; N
; G( x5 h* ]# ~; Y" W5 n3 F$ j/ r
你好，看到你回复的帖子，可能小鼠间充质干细胞做得比较多的，想跟你请教一下。
* y+ z2 B, m7 P5 u3 |# @% h我也在养小鼠的间充质干细胞，原代细胞状态很好，没有添加任何细胞因子，但是传代以后细胞形态发生很大变化，没有立体感，扁平，铺展开来，采用DMEM高糖培养基（GIBCO)和10％的胎牛血清（hyclone）,传代消化时间2分钟，0.25％胰酶和0.02的EDTA, 初次传代消化下来的细胞数量很少，基本是2：1传代，细胞生长起来倒是很快，就是形态变化很大，3代以后成骨诱导，平铺的细胞又慢慢聚集成堆生长，附带有几张图。1 h* O% g# }+ u& y# _
请问你再培养过程中遇到类似的问题了吗？如何解决的，指点一下，多谢啦!
7 r/ f; E1 n; }4 ?( r5 s# l8 x  x6 A+ d. k  F
如有碰到同样问题的，请大家交流一下

bathpp2007

wanglijing2011 发表于 2011-11-16 16:34
8 E7 k0 [+ ?! A; I$ g2 m: ^" e回复 hnsdlgl 的帖子
4 Z: s, ]/ K$ d; Y( z3 o7 N1 t% C
$ D* L5 b1 f1 I8 |; T' c2 ~你好，看到你回复的帖子，可能小鼠间充质干细胞做得比较多的，想跟你请教一下。

7 t( R$ P  F& ^0 u  N. l; V
你好，看到你的图片觉得你养得真不错，P2P3代是刚传代的样子吗？它们长到80%左右大约要多少天？我的P1代都14天了，也就是30－50%的模样。。。。。。。。