求助：关于犬骨髓干细胞表型CD90/CD45流式鉴定？

stefan

   求助：关于犬骨髓干细胞表型CD90/CD45流式鉴定？6 O+ u2 ]. s# M/ N& y$ P- I
  1、近段时间准备对犬骨髓干细胞表型CD90/CD45作流式鉴定，但是无法买到抗犬的细胞表型抗体，想用人的抗体代替，不知道能不能行？有哪位大侠做过的指教指教？？- l$ W5 y; B- X5 q7 D- _/ e( y
  2、还有就是想请教有人用过eBioscience公司的流式细胞产品吗，不知道效果怎么样？
$ L. u) J6 f# F  3、小弟刚开始做流式，这方面比较不熟悉，了解的朋友能否给个流式细胞细胞表型鉴定具体的实验步骤啊？越具体越好，这里先行谢过了！

ylj

这抗体是很少用，不过想提醒LZ，间充质鉴定光用以上两抗体是不成立的！
( N8 B% C7 d7 m* r. r( F4 Q流式表面抗体发育我们一般是：
3 t1 D6 A) E0 p$ @- f1、收集细胞，分装；
( C! c  Y2 e; `) I& m9 J2、PBS洗两次，200G离心5min;
; I8 P  z: s3 A7 a) ?1 k. [0 o, N3、50ul PBS重悬，加入相应抗体混匀，4°避光孵育半小时（10min混匀一次）；
$ K# n, |1 Q) U9 |  r' E% \5 f4、取出加入1ml PBS洗两次；
$ @( [; ]1 K2 f. _( I5、200ul PBS重悬后直接上机或1%多级甲醛固定后4°保存待检。

卡门

eBioscience公司的流式产品我们实验室也有很多人用，比起BD的要稍微差一点，但你需要检测的指标比较一般，没有特殊的要求或表达量很低，所以用他们公司的足够了。
$ N, J% `, w3 G6 h3 z4 v0 i! h一般买的流式抗体都是一抗上带了荧光的，所以可以直接染，而且你要检测指标都是膜上的，步骤比较简单：
' p. w) O4 s" I1 g, U/ b8 I我们的染色步骤，供参考：- ]' ^8 o8 ^0 A; F- K0 h. s
   1x10*6---10*7的细胞用PBS洗涤，1500rpm  5min
8 ~, ?3 K1 a4 b3 ~6 Y7 u/ @% [     去除上清，用PBS100-200ul重悬* b% Q( t0 U* ]" u2 g* O' Z
   加入流式抗体，根据说明书每个test的用量，其实可以稍微少加，有人用一半的量也能做出，但该开始的时候，还是按说明书来加% Y' \# ]" P5 w0 ?# w# J
   4度避光孵育15-20min，加入1ML的PBS重悬、混匀
7 p1 Q" Q/ u, g   1500rpm 5min离心，去除上清，重复2-3遍
+ n7 P' V& L8 ~/ O   最后去上清后用300ulPBS重悬，混匀后即可上机检测
+ T. l- \" ^1 r9 E+ z: V' ]PS:染色过程中，注意尽量避光，及4度孵育的环境

gact

看看基因序列，，，，

wangzhiqi86

回复 stefan 的帖子; `7 M# g) y# U; G! d  ]

: k8 \  w, K% J$ t买抗人和抗鼠的，与犬有杂交的也行，但是交叉结合效率就不好说了

wangzhiqi86

回复 stefan 的帖子
* E8 C. y7 ?4 d  G5 s5 u
' `4 r% {% I/ S$ a. V' i# D$ x抗犬的估计很难买，因为大多数都是抗人和抗鼠的，我当时买抗兔的也很难买到，建议你几个公司吧，millipore、AbD Serotec、Antigenix America、BD，这几个都不错，特别是Antigenix America的很多抗体都是别的公司没有的。
" M# `3 S' M0 l1 P' j& ^这是我做的具体步骤，你参考一下  c- ?7 ?5 Z% Q% x# T. u/ `* ]
①P5×105 cells—1×106 cells/样" T' Z, `( ]9 y4 w4 H
②抗体稀释液洗涤: D* y) R5 k$ {+ `* Z) R4 v
③加入一抗，4℃避光孵育30min
7 W, A$ _6 M* ~+ C) _& T④抗体稀释液洗涤+ s/ x* e7 c) u- C7 B6 N5 o1 H
⑤加入二抗，常温避光孵育9 R) K5 U  U' d" j
⑥抗体稀释液洗涤( M" j) a0 @) ?3 k
⑦加入抗体保存液，4℃避光保存待测
( h" A% e+ ]3 K  F注：如果一抗自身带有抗体，那就不需要⑤、⑥步。