求助：关于犬骨髓干细胞表型CD90/CD45流式鉴定？

stefan

   求助：关于犬骨髓干细胞表型CD90/CD45流式鉴定？
3 m- D% I: D$ |: c' @! [0 A  1、近段时间准备对犬骨髓干细胞表型CD90/CD45作流式鉴定，但是无法买到抗犬的细胞表型抗体，想用人的抗体代替，不知道能不能行？有哪位大侠做过的指教指教？？
% v7 y" H" a. L1 F6 A0 Q( s  2、还有就是想请教有人用过eBioscience公司的流式细胞产品吗，不知道效果怎么样？6 o( ^: d8 D- {/ }* A- X3 J
  3、小弟刚开始做流式，这方面比较不熟悉，了解的朋友能否给个流式细胞细胞表型鉴定具体的实验步骤啊？越具体越好，这里先行谢过了！

wangzhiqi86

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/ E2 t: x/ b4 z9 O
& E9 b- R- h$ v抗犬的估计很难买，因为大多数都是抗人和抗鼠的，我当时买抗兔的也很难买到，建议你几个公司吧，millipore、AbD Serotec、Antigenix America、BD，这几个都不错，特别是Antigenix America的很多抗体都是别的公司没有的。
) _$ _+ [% w) U7 E+ v5 \这是我做的具体步骤，你参考一下, v9 V& k: s6 l6 L# d
①P5×105 cells—1×106 cells/样
! C: M" X6 l& O2 k" Y; k  e②抗体稀释液洗涤* b4 H; C2 `6 l3 S* {9 F
③加入一抗，4℃避光孵育30min/ r  Y5 N/ I6 |1 W
④抗体稀释液洗涤' V2 C* [0 Q/ s, C* i
⑤加入二抗，常温避光孵育. \3 y/ D0 i8 v- m  K3 ?
⑥抗体稀释液洗涤* m, N  T+ L/ Y& u+ O
⑦加入抗体保存液，4℃避光保存待测1 w6 f6 z4 \8 \. I/ R1 y
注：如果一抗自身带有抗体，那就不需要⑤、⑥步。

wangzhiqi86

回复 stefan 的帖子$ c' Z* P# ~1 Z) N7 @1 I- E  u
3 ?/ x* e! C+ Q: b
买抗人和抗鼠的，与犬有杂交的也行，但是交叉结合效率就不好说了

gact

看看基因序列，，，，

卡门

eBioscience公司的流式产品我们实验室也有很多人用，比起BD的要稍微差一点，但你需要检测的指标比较一般，没有特殊的要求或表达量很低，所以用他们公司的足够了。9 v. l7 M  p9 C: S) p( o8 ]
一般买的流式抗体都是一抗上带了荧光的，所以可以直接染，而且你要检测指标都是膜上的，步骤比较简单：/ e& k* P; y6 z' G( h, Y. g
我们的染色步骤，供参考：, a" n# r. U: |
   1x10*6---10*7的细胞用PBS洗涤，1500rpm  5min5 s/ |' O: ^/ i: h. T
     去除上清，用PBS100-200ul重悬
3 Z# ]$ C9 A8 w4 j, W' m0 q   加入流式抗体，根据说明书每个test的用量，其实可以稍微少加，有人用一半的量也能做出，但该开始的时候，还是按说明书来加* Z7 H: _+ f- p- C/ }0 x9 |4 U
   4度避光孵育15-20min，加入1ML的PBS重悬、混匀
% P. ~3 W% p+ V  s' _+ Q   1500rpm 5min离心，去除上清，重复2-3遍0 v" C/ F( c! t" F1 d/ u. s
   最后去上清后用300ulPBS重悬，混匀后即可上机检测
; l8 Z6 p: M' b, v7 }* PPS:染色过程中，注意尽量避光，及4度孵育的环境

ylj

这抗体是很少用，不过想提醒LZ，间充质鉴定光用以上两抗体是不成立的！& i" u7 n( ]7 u( q, @% {
流式表面抗体发育我们一般是：+ P0 Y. D5 \( U
1、收集细胞，分装；, L% z7 t5 X& k
2、PBS洗两次，200G离心5min;% l7 W, S4 a0 n5 A! z
3、50ul PBS重悬，加入相应抗体混匀，4°避光孵育半小时（10min混匀一次）；6 `& S9 [9 x2 A: M$ H1 q: P
4、取出加入1ml PBS洗两次；/ f, Y, h, G2 z; n, M
5、200ul PBS重悬后直接上机或1%多级甲醛固定后4°保存待检。