微孔板实验如何减少"边缘效应"

Temin

各位大虾，大家在用96-或/和384-微孔板做cell-based assay的时候，是否会遇到边缘效应（Edge Effect），表现出来的效应一般是边缘的一圈well读值异常，我观察和请教了周边的人，大家对这种效应的处理，一般有这几种方式：% Z) B1 \2 v( Y0 q' G3 F
1、周围一圈微孔放弃不用，不种细胞，而是铺上培养基或者水；) C$ R/ @* I' A3 [8 \
2、Microplate在CO2培养箱培养时，周围用加样槽或者其他容器装水，使得microplate周围的湿度加大；, _) F+ _5 f' s
3、Microplate放入培养箱之前，先在室温平衡30min或者60min，待细胞贴壁之后再将microplate放入培养箱；
! Y7 B1 \" e- l  v4、方法2和方法3的组合。- ^' T1 `+ D' k: |+ ?
根据经验，不同的细胞类型，边缘效应的影响各异；对24h的实验来讲，边缘效应有些细胞可能影响极微，但是对有些细胞来讲，影响极大，甚至都不能开关培养箱门（这个见有人单独霸占一个培养箱，里面就放着他的几块96孔板）；而对72h或者更长培养时间的实验，边缘效应一般很大，经常导致周围的一圈微孔不能使用。1 w$ \: O0 y& w7 l  r. N; _9 u
那么，我一直很想知道，边缘效应的原因是什么，在上述方法2的理念里，是因为蒸发效应，导致培养基里水分减少，渗透压等理化因素变化，影响细胞的生长，所以在周围加水增加湿度，可以减少边缘效应。在上述方法3的理念里，是因为温度不平衡，骤然把微孔板从室温放入37度，那么周边孔更早升温，而这个时候细胞还在沉降，会向边缘的温度高的地方飘去降落，造成细胞密度局部加大，因为细胞的接触抑制，所以边缘的孔里面细胞生长速度减慢，所以造成边缘效应。
8 W! J3 {3 \, [" H" e我觉得两种说法都有道理，但是，在实际当中，边缘效应还是无法避免，只能降到一个差不多可以接受的水平（相对微孔板中央位置，差异10%以内。）
5 r+ i2 s1 t& n: H* l所以，我想请教大家，你们是怎么操作的？对于边缘效应的理论又是什么？谢谢！
1 [! P( a' d% _1 E! v  k. D附件中是一篇关于边缘效应的文章，供大家参考。A Simple Technique for Reducing Edge Effect in Cell-Based Assays

shen_coco

我一般都只采用第一种方法，就是最外面的孔加PBS，确实存在一定的边缘效应

naturalkillerce

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- o' U' ?  O0 U8 _: l/ c* n这个学习一下，平时做实验时，经常用到，谢谢楼主分享。

hkenb

在用EDTA传代时，也发现类似的“边缘效应”。孔边上细胞贴得很牢，但是中间基本没有贴。中间没有贴，可能是处理时间有点过的原因，但是边上贴得很牢就不好解释了。请教大虾！

Temin

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* O1 R) E9 ^" E( W# [1 ~1 _% Z2 Q, ^' g- D/ Y
坐等大虾～～～

aulenuyah

下来看看

bin

第一次听说边缘效应，不过以前用96孔板时周围一圈是不用的，加无菌水，好像是为了防止中心的孔板内液体蒸发。

phdyhm

在酶联免疫反应（ELISA）中常发现有“边缘效应”，即96孔板的外周孔显色较中心孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因。孔板的聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。 　　9 a) r% ?7 G0 r3 y. V/ h
解决办法是使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。

luoziwei

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- H4 S3 n% D/ P6 O" o; W( V+ N, [" N  y2 F, O6 u
楼主，给你补充一个，还有低氧造成的，就是氧气在孔板内分布不均。很多学生做实验都知道有这种影响存在，也知道周边一圈不种细胞，但没几个愿意查明原因，说明楼主很细心嘛。

Temin

回复 luoziwei 的帖子3 x  r$ w$ B* m- c7 j1 ^& |. f/ {
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谢谢你的建议，氧气的因素应该也很大，你那里有相关的文献资料吗？