综合讨论：脐带间充质干细胞的分离，传代和分化的问题

henryjia

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# p0 G! R7 t% ]7 j* y6 P4 r3 y2 o做脐带间充质干细胞的分离有差不多1年了，在此分享一下自己的经验，同时，抛砖引玉，希望大家多提宝贵意见，以完善这个主题研究信息。
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/ {0 J& o! f- |9 R先说细胞分离：比对很对方法后，感觉I型胶原酶联合透明质酸酶消化最理想。但是仍然个体差异性非常明显。 而且这个方法不能过扩展到脐带动静血管的消化。9 p( U9 S' B; P6 b$ Y# P- l7 j0 l

0 q6 k! a2 }4 S# }- \8 N% B* ?! J' N其次，消化法时掌握不好消化时间，看文献有的说消化过夜，有的说6h的。一直不成功，仍然个体差异性非常明显。过夜消化似乎对细胞损害很大，不知道添加少量血清是否有保护作用。
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培养基：使用含10%血清的骨髓MSC相同培养基，发现很快（3代左右）细胞老化明显，及时添加bFGF也不能阻止。3 `3 g' @2 Q( v

: |7 T# x( Z5 Q* X9 n, H5 B. a传代：一直使用0.25%胰酶加EDTA（SIGMA），必须要用含血清培养基中和。感觉效果还行。同样有不少细胞贴壁很难弄下来。请问，这部分细胞是不是干细胞？要还是不要呢？2 i9 f& Y8 _8 r

, t5 F$ e& T9 i多分化潜能的功能测试：这是最头痛的，与骨髓MSC相比，结果简直就是成纤维细胞，根本不像MSC。即使之前FACS表面抗原CD90,CD105, VACAM与MSC很接近。 成脂成骨作用很弱，不知道大火的结果如何？真如报道的那么好吗？我怎么做不出来？
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附上我的细胞照片：
3 r" D% e( p, k3 U, E. N图1是直接贴壁8 o& {( x9 _( W

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- |3 o% b% |" p  }* g图2是酶消化9 ]5 [7 A2 y3 Y8 D

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4 Y0 ~6 c1 D2 {( }" J# `2 T+ k" I1 p图3， 是否是平滑肌细胞呢？ 这是我从期待静脉内层剥离的组织消化培养出来的。4 l& u: h4 d- l+ `# l  ^
感觉当时是有华通胶混杂其中，但是细胞形态均一。很奇怪。最初目的是分离脐静脉平滑肌细胞。% ]+ V; Y" u% k

henryjia

% p- `3 ]: i( w" Z* b( |最经看报道有从大隐静脉外膜提取干细胞，与心血管发生相关。正在尝试。
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上周比较了脐带静脉与动脉的消化，发现结果非常不同。相同消化条件下，脐带静脉细胞竟然很少有存活的！
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我理解细胞壁厚薄有区别，难道细胞类型也有区别吗？

紫电苍炎

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9 s. N- U4 L. v2 h$ V7 a+ W. d不完全是绝对的，话说用不着消化那么完全吧！ 干细胞增殖能力那么强，只有有些微活细胞就足够了。你说的比重离心我们这边没有做...

sailree

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$ @" f2 R* {  z1 R4 h组织块法

zxcv12345

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) m! U2 d8 t3 r$ t2 _) F2 K* A1 g  t) h
我们分离osteoblast时，半小时后，取走消化液PBS稀释，样品接着加新酶继续消化，感觉这里也可用这个方法吧。消化时间过长不好

henryjia

回复 紫电苍炎 的帖子. ^3 I1 r* I, c5 R. ^$ r. P
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60min能够消化完全吗？我尝试过，似乎很难？不知道一些论文中消化后，直接做细胞筛选是怎么实现的？
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发表的论文比较经典的是，酶消化后，比重离心分离单核细胞后，用表面抗体标记细胞，之后进行筛选。这个过程至少要6-8个小时。细胞还能健康吗？我的细胞还没有复苏过来的，很苦闷！

紫电苍炎

我们这边就是PBS直接配置 也是2mg/ml 但是我们这边的笑话时间只有60min！尝试过半小时 1小时  2小时以及过夜笑话！2小时的话细胞得率有增加大概10%的增加相较于1小时，但是隔夜消化的细胞就很少了！

农夫有点田

回复 henryjia 的帖子- N8 f! v9 U4 r. U! d

& v) I  C% z4 h7 h我买的是GIBCO 的 直接用去离子水配成1mg/ml

henryjia

回复 zxiaoxiao311 的帖子! |. a5 X+ D+ m$ f  R' L4 l
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生长慢，形态变化，变大，不规则

henryjia

回复 zxiaoxiao311 的帖子) R8 h: o6 r7 n- h: V! `
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生长慢，形态变化，变大，不规则