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综合讨论:脐带间充质干细胞的分离,传代和分化的问题   [复制链接]

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金话筒 优秀会员 帅哥研究员

楼主
发表于 2011-12-2 08:03 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 henryjia 于 2011-12-2 08:04 编辑 * a3 i0 e! P+ U! p: O2 F" N2 B

3 F/ h) \- U' M* w# {( G9 o% d做脐带间充质干细胞的分离有差不多1年了,在此分享一下自己的经验,同时,抛砖引玉,希望大家多提宝贵意见,以完善这个主题研究信息。0 W0 p  A0 C/ K
1 N5 y3 ^3 P: [. b6 e9 I
先说细胞分离:比对很对方法后,感觉I型胶原酶联合透明质酸酶消化最理想。但是仍然个体差异性非常明显。 而且这个方法不能过扩展到脐带动静血管的消化。
( f0 C: n$ L& G/ d) X
; Q# r0 E0 J; J1 v6 A$ f7 r其次,消化法时掌握不好消化时间,看文献有的说消化过夜,有的说6h的。一直不成功,仍然个体差异性非常明显。过夜消化似乎对细胞损害很大,不知道添加少量血清是否有保护作用。( I) }2 f, t1 g/ g
' i0 a) D" P* J& A
培养基:使用含10%血清的骨髓MSC相同培养基,发现很快(3代左右)细胞老化明显,及时添加bFGF也不能阻止。9 [% h+ w. e3 t+ T

& N- Q- f' a* [1 P传代:一直使用0.25%胰酶加EDTA(SIGMA),必须要用含血清培养基中和。感觉效果还行。同样有不少细胞贴壁很难弄下来。请问,这部分细胞是不是干细胞?要还是不要呢?
0 [5 c( G# ~; f4 P; x' k* j% D2 i- Y3 W' s# g8 l
多分化潜能的功能测试:这是最头痛的,与骨髓MSC相比,结果简直就是成纤维细胞,根本不像MSC。即使之前FACS表面抗原CD90,CD105, VACAM与MSC很接近。 成脂成骨作用很弱,不知道大火的结果如何?真如报道的那么好吗?我怎么做不出来?
: D+ h* [- K! E0 D# I8 l; \
- {# g) N" a& j附上我的细胞照片:
. W1 Z+ e) z. \: e% J图1是直接贴壁( W1 ?. [$ [0 E, V
6 X# Y% O7 g3 r) j
/ B' o% B( z2 z" a6 c$ R8 N, e
图2是酶消化+ T2 C: b  T6 x6 d# P1 f$ {  U) y3 [

: x+ I1 J' a' j' _/ x- W: P  t5 E. J5 v
图3, 是否是平滑肌细胞呢? 这是我从期待静脉内层剥离的组织消化培养出来的。
( K: I* ^& e8 K9 h2 N5 G0 P) a感觉当时是有华通胶混杂其中,但是细胞形态均一。很奇怪。最初目的是分离脐静脉平滑肌细胞。$ P( X8 p, ]# I" h% Y
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沙发
发表于 2011-12-2 08:23 |只看该作者
我只做脐带间充质干细胞的分离 没楼主知识面广 但是看了您的胶原酶时间消化6h 是不是太长了呢?我做的是不超过60分  如果酶是新配的 活性很强的话 就缩短些 个人经验 仅供参考
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藤椅
发表于 2011-12-2 08:49 |只看该作者
看上去不错。
9 c# j6 Y% Z. ~消化困难的也是干细胞,不过形态扁平,比较老化,诱导分化困难,可以舍弃。
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板凳
发表于 2011-12-2 09:03 |只看该作者
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本帖最后由 henryjia 于 2011-12-2 09:05 编辑 9 {/ T* g6 L' H/ S4 D" `

; C  v8 u0 H. Y% G7 k回复 农夫有点田 的帖子6 t5 ?# H2 l1 e+ w

" ^+ Y+ `9 v) j% Q" |我用的胶原酶都是当天配置的(使用浓度1mg/ml or 2mg/ml,溶解于低糖DMEM中),可是消化效果很慢。 请问您使用什么试剂配置的呢?我的胶原酶I型是SIGMA买的。
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报纸
发表于 2011-12-2 09:11 |只看该作者
楼主的图片1和2是在相同倍数下照的吗?感觉酶消化法的细胞要大得多。楼主的细胞三代就开始老化现象,主要指的是什么,长得慢?细胞形态有所变化?
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地板
发表于 2011-12-2 09:25 |只看该作者
我们组织贴壁也做过二型胶原酶消化脐带,1-3h的消化时间都试过,发现消化时间越长,消化液越粘稠,不容易过滤,需要加大量缓冲液稀释后过滤,离心才能得到细胞。至于细胞形态,觉得组织贴壁得到的梭型细胞多。
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发表于 2011-12-2 10:58 |只看该作者
酶消化不是好方法,对细胞质量影响还是很大得出来的细胞容易分化,形态扁平。
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发表于 2011-12-2 12:36 |只看该作者
sailree 发表于 2011-12-2 10:58   g5 [  D$ t8 y. C% Y! A, ^4 w
酶消化不是好方法,对细胞质量影响还是很大得出来的细胞容易分化,形态扁平。
4 c1 w# j# |+ [' M# A9 s' z
我现在就是遇到这种情况,传代后细胞扁平,出现老化现象,请问你们是怎么解决这种问题的,有没有其他的方法
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发表于 2011-12-2 14:37 |只看该作者
本帖最后由 wind789 于 2011-12-2 14:39 编辑
% z2 g3 d7 |5 Z( o" f$ N* o
: [. z7 d, h2 _9 K- `回复 eggnihao 的帖子9 _. ^/ H( |! B5 A

$ C9 S) K6 ~. d- a消化完的果冻用大量PBS稀释,只离心清洗一次。+ m7 w2 C9 ]. C) I3 ^/ r4 m
传代的时候镜下细胞稍变圆就立即中止消化,加入完全培养基,反复轻柔吹打瓶壁。
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发表于 2011-12-2 17:09 |只看该作者
回复 zxiaoxiao311 的帖子
( T- N3 g0 s$ [! L8 }& U( i
) ~! G' ~. T3 M) w- e1 U. T9 G2 r生长慢,形态变化,变大,不规则
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