综合讨论：脐带间充质干细胞的分离，传代和分化的问题

henryjia

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# p6 K/ F% @1 \做脐带间充质干细胞的分离有差不多1年了，在此分享一下自己的经验，同时，抛砖引玉，希望大家多提宝贵意见，以完善这个主题研究信息。! [) c3 _  z  P- s6 F; z5 ?
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先说细胞分离：比对很对方法后，感觉I型胶原酶联合透明质酸酶消化最理想。但是仍然个体差异性非常明显。 而且这个方法不能过扩展到脐带动静血管的消化。
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% f2 h) o6 c4 j6 ^2 j) d其次，消化法时掌握不好消化时间，看文献有的说消化过夜，有的说6h的。一直不成功，仍然个体差异性非常明显。过夜消化似乎对细胞损害很大，不知道添加少量血清是否有保护作用。
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培养基：使用含10%血清的骨髓MSC相同培养基，发现很快（3代左右）细胞老化明显，及时添加bFGF也不能阻止。
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' o; k( f6 t# I9 k2 k1 h传代：一直使用0.25%胰酶加EDTA（SIGMA），必须要用含血清培养基中和。感觉效果还行。同样有不少细胞贴壁很难弄下来。请问，这部分细胞是不是干细胞？要还是不要呢？9 T% Q, v: d! x% m% G' j

0 C8 `# m: d% `: e多分化潜能的功能测试：这是最头痛的，与骨髓MSC相比，结果简直就是成纤维细胞，根本不像MSC。即使之前FACS表面抗原CD90,CD105, VACAM与MSC很接近。 成脂成骨作用很弱，不知道大火的结果如何？真如报道的那么好吗？我怎么做不出来？' ?" r8 U, Y" n$ n; c& V
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附上我的细胞照片：! m7 n/ H2 P- d5 @
图1是直接贴壁
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图2是酶消化
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, b2 b; L! T7 T# O7 y/ X) @图3， 是否是平滑肌细胞呢？ 这是我从期待静脉内层剥离的组织消化培养出来的。
/ Q7 V2 V: z; w- [, h9 z6 ~3 E% V感觉当时是有华通胶混杂其中，但是细胞形态均一。很奇怪。最初目的是分离脐静脉平滑肌细胞。1 L5 W  U6 [2 m, j9 Z

农夫有点田

我只做脐带间充质干细胞的分离 没楼主知识面广 但是看了您的胶原酶时间消化6h 是不是太长了呢？我做的是不超过60分  如果酶是新配的 活性很强的话 就缩短些 个人经验 仅供参考

meister

看上去不错。* K; H" G0 v3 M: ~
消化困难的也是干细胞，不过形态扁平，比较老化，诱导分化困难，可以舍弃。

henryjia

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* T9 A6 ^8 l: V! G+ m/ q; G回复 农夫有点田 的帖子
6 J+ c# L& H& a. m& r. q, Z7 d2 `+ T& z, |% a
我用的胶原酶都是当天配置的（使用浓度1mg/ml or 2mg/ml，溶解于低糖DMEM中），可是消化效果很慢。 请问您使用什么试剂配置的呢？我的胶原酶I型是SIGMA买的。

zxiaoxiao311

楼主的图片1和2是在相同倍数下照的吗？感觉酶消化法的细胞要大得多。楼主的细胞三代就开始老化现象，主要指的是什么，长得慢？细胞形态有所变化？

liluli0715

我们组织贴壁也做过二型胶原酶消化脐带，1-3h的消化时间都试过，发现消化时间越长，消化液越粘稠，不容易过滤，需要加大量缓冲液稀释后过滤，离心才能得到细胞。至于细胞形态，觉得组织贴壁得到的梭型细胞多。

sailree

酶消化不是好方法，对细胞质量影响还是很大得出来的细胞容易分化，形态扁平。

eggnihao

sailree 发表于 2011-12-2 10:58
7 G' [9 s5 ]& ?% W% `1 z( T酶消化不是好方法，对细胞质量影响还是很大得出来的细胞容易分化，形态扁平。

5 j" c( X+ X, x( C# y& o我现在就是遇到这种情况，传代后细胞扁平，出现老化现象，请问你们是怎么解决这种问题的，有没有其他的方法

wind789

3 v: G: P% T, c& m

. ]$ g/ W$ D; O/ W/ m, M. N) K; d回复 eggnihao 的帖子6 k* U, H, i$ F9 i( y

$ h5 v8 {7 x4 m消化完的果冻用大量PBS稀释，只离心清洗一次。$ ]; M7 g. t* F: G* t* L( N! x# d
传代的时候镜下细胞稍变圆就立即中止消化，加入完全培养基，反复轻柔吹打瓶壁。

henryjia

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% e' X/ q- c4 s: I! Y9 Z0 g3 ]生长慢，形态变化，变大，不规则