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综合讨论:脐带间充质干细胞的分离,传代和分化的问题   [复制链接]

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金话筒 优秀会员 帅哥研究员

楼主
发表于 2011-12-2 08:03 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 henryjia 于 2011-12-2 08:04 编辑
' U( |' P; s1 }' g9 g/ U
2 s) u! B% r* s2 z7 y' f& W做脐带间充质干细胞的分离有差不多1年了,在此分享一下自己的经验,同时,抛砖引玉,希望大家多提宝贵意见,以完善这个主题研究信息。
6 M3 W% I( n1 l- R0 w( u7 F3 x/ `# a5 S3 j# V
先说细胞分离:比对很对方法后,感觉I型胶原酶联合透明质酸酶消化最理想。但是仍然个体差异性非常明显。 而且这个方法不能过扩展到脐带动静血管的消化。  r1 t. L$ N/ ~. c& W. p

. E& W* W$ S. h" @0 P) Z. s其次,消化法时掌握不好消化时间,看文献有的说消化过夜,有的说6h的。一直不成功,仍然个体差异性非常明显。过夜消化似乎对细胞损害很大,不知道添加少量血清是否有保护作用。0 f. |% K! @* e

$ X2 s; w: ^* V2 O& c( v培养基:使用含10%血清的骨髓MSC相同培养基,发现很快(3代左右)细胞老化明显,及时添加bFGF也不能阻止。
. r$ V0 Y+ F% d- w6 B6 P5 z2 s$ C) e  b' G& Q
传代:一直使用0.25%胰酶加EDTA(SIGMA),必须要用含血清培养基中和。感觉效果还行。同样有不少细胞贴壁很难弄下来。请问,这部分细胞是不是干细胞?要还是不要呢?
/ x0 p* c  O  H; @1 I
' b# l  W" U4 e; Y; u* m! t多分化潜能的功能测试:这是最头痛的,与骨髓MSC相比,结果简直就是成纤维细胞,根本不像MSC。即使之前FACS表面抗原CD90,CD105, VACAM与MSC很接近。 成脂成骨作用很弱,不知道大火的结果如何?真如报道的那么好吗?我怎么做不出来?
, Z9 N5 Q) m% M: x  C& _
5 w* P3 n! G, b; o1 V5 q附上我的细胞照片:
; S+ u% [9 y7 e' {' u) N! B图1是直接贴壁# k1 b$ s2 _3 w4 c  j
! n  W) x# q! H

; `1 R% r, B( _图2是酶消化, ]( z- l& t7 W# N0 @+ ]
* w+ t8 z: j) p7 k' J1 n! R# ^6 z4 {
! O( ]* [  L3 p: e1 K
图3, 是否是平滑肌细胞呢? 这是我从期待静脉内层剥离的组织消化培养出来的。
: Y1 _. [7 S1 }% ]; I" L& \8 N感觉当时是有华通胶混杂其中,但是细胞形态均一。很奇怪。最初目的是分离脐静脉平滑肌细胞。
0 y- |* c; F& F1 C
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沙发
发表于 2011-12-2 08:23 |只看该作者
我只做脐带间充质干细胞的分离 没楼主知识面广 但是看了您的胶原酶时间消化6h 是不是太长了呢?我做的是不超过60分  如果酶是新配的 活性很强的话 就缩短些 个人经验 仅供参考
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藤椅
发表于 2011-12-2 08:49 |只看该作者
看上去不错。) W* g$ P, E8 B
消化困难的也是干细胞,不过形态扁平,比较老化,诱导分化困难,可以舍弃。
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板凳
发表于 2011-12-2 09:03 |只看该作者
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本帖最后由 henryjia 于 2011-12-2 09:05 编辑
( \2 g2 w! a1 C. P, b' W
  P7 ^+ z- Y0 a6 I7 O: S& y回复 农夫有点田 的帖子
- s& U' \$ z8 o) I
, p! n$ g) _6 J4 x9 u% e# w2 i/ G我用的胶原酶都是当天配置的(使用浓度1mg/ml or 2mg/ml,溶解于低糖DMEM中),可是消化效果很慢。 请问您使用什么试剂配置的呢?我的胶原酶I型是SIGMA买的。
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报纸
发表于 2011-12-2 09:11 |只看该作者
楼主的图片1和2是在相同倍数下照的吗?感觉酶消化法的细胞要大得多。楼主的细胞三代就开始老化现象,主要指的是什么,长得慢?细胞形态有所变化?
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地板
发表于 2011-12-2 09:25 |只看该作者
我们组织贴壁也做过二型胶原酶消化脐带,1-3h的消化时间都试过,发现消化时间越长,消化液越粘稠,不容易过滤,需要加大量缓冲液稀释后过滤,离心才能得到细胞。至于细胞形态,觉得组织贴壁得到的梭型细胞多。
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发表于 2011-12-2 10:58 |只看该作者
酶消化不是好方法,对细胞质量影响还是很大得出来的细胞容易分化,形态扁平。
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发表于 2011-12-2 12:36 |只看该作者
sailree 发表于 2011-12-2 10:58 ) ]) y$ u( i: `8 m9 t( x- K
酶消化不是好方法,对细胞质量影响还是很大得出来的细胞容易分化,形态扁平。
# R0 h4 f6 N) ]) `: F
我现在就是遇到这种情况,传代后细胞扁平,出现老化现象,请问你们是怎么解决这种问题的,有没有其他的方法
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发表于 2011-12-2 14:37 |只看该作者
本帖最后由 wind789 于 2011-12-2 14:39 编辑 / G3 C+ U! _5 Y
! K3 L0 [& x+ M3 E9 v+ a
回复 eggnihao 的帖子
& |- {/ G% C: ~6 D' ^6 K# x/ d+ N% d
消化完的果冻用大量PBS稀释,只离心清洗一次。
3 h* S! U3 H6 x2 a3 I4 D( y传代的时候镜下细胞稍变圆就立即中止消化,加入完全培养基,反复轻柔吹打瓶壁。
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发表于 2011-12-2 17:09 |只看该作者
回复 zxiaoxiao311 的帖子
% |4 N/ N6 D: r. i+ ?, e+ A# ]. H0 o
生长慢,形态变化,变大,不规则
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