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Y染色体sry基因原位杂交操作步骤：
9 G: a& _1 v: x3 L5 ~; D9 S& b一、PCR合成大鼠Y染色体特异性cDNA探针4 w9 }1 S; r& [6 F! n2 f
1、 把107个细胞接种到400μl TNE缓冲液中（10mmol/L Tris、Ph7.9; 10mmol/L NaCl；10mmol/L ethylenediaminetetra-acetic acid），与400μl 20% 十二烷基磺酸钠和40μl 蛋白酶K（20mg/ml）混合。悬液涡旋混匀，37℃孵育12－15h。
& t4 m8 m: D+ w- h! K( p( _" K2、 DNA用苯酚提取，乙醇沉淀，TE溶解（1mmol/L Tris、ph7.9; 0.1 mmol/L of ethylenediaminetetra-acetic acid）。
( n& v; T9 T! [! n3、引物序列设计如下：5' primer, 5'-AGATCTTGATTTTTAGTGTTC-3' and 3' primer, 5'-TGCAGCTCTACTCCAGTCTTG-3'。反应混合物包括1μg基因组DNA、引物各1μm、200μm三磷酸二核苷酸、1×PCR buffer，和2单位Taq聚合酶，终体积为100μl。进行30次扩增，每个循环包括94℃变性1min、50℃退火1min、72℃扩增2min。30次循环后，再在72℃附加扩增7min。PCR产物0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，溴乙锭染色检测片断大小，然后纯化准备杂交。$ P; } U+ n% m; N9 l$ Y( X& I
二、原位杂交+ l% [0 t. z5 x) v
1、 切片去蜡，二甲苯水化，过梯度酒精，然后用蛋白酶K（100μg/ml）37℃消化15min。# u3 A. p7 b3 {) D0 k) r
2、 前面制备好的Y染色体cDNA探针用地高辛标记检测试剂盒做标记。
0 V0 b7 b2 i2 u" M$ j# j3、 杂交液在42℃过夜。用荧光抗体增强试剂盒（Boehringer Mannheim）可以在荧光显微镜下观察到地高辛标记的Y染色体，由异硫氰酸盐荧光素发绿色光。然后载玻片用10ng/ml亚丙基碘化物（Propidium Iodide，红色）复染，以使细胞核染色，加抗退色液和盖玻片。阴性对照不加探针或抗地高辛抗体，其它按相同操作。
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发表于 2011-12-4 02:45
