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Y染色体sry基因原位杂交操作步骤：; }. n: Q' o" N/ ~
一、PCR合成大鼠Y染色体特异性cDNA探针( y" z! M2 w! ~! S, D) R8 R
1、 把107个细胞接种到400μl TNE缓冲液中（10mmol/L Tris、Ph7.9; 10mmol/L NaCl；10mmol/L ethylenediaminetetra-acetic acid），与400μl 20% 十二烷基磺酸钠和40μl 蛋白酶K（20mg/ml）混合。悬液涡旋混匀，37℃孵育12－15h。: N& u4 _' z; Q* A+ @
2、 DNA用苯酚提取，乙醇沉淀，TE溶解（1mmol/L Tris、ph7.9; 0.1 mmol/L of ethylenediaminetetra-acetic acid）。0 w0 G6 h- x# @
3、引物序列设计如下：5' primer, 5'-AGATCTTGATTTTTAGTGTTC-3' and 3' primer, 5'-TGCAGCTCTACTCCAGTCTTG-3'。反应混合物包括1μg基因组DNA、引物各1μm、200μm三磷酸二核苷酸、1×PCR buffer，和2单位Taq聚合酶，终体积为100μl。进行30次扩增，每个循环包括94℃变性1min、50℃退火1min、72℃扩增2min。30次循环后，再在72℃附加扩增7min。PCR产物0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，溴乙锭染色检测片断大小，然后纯化准备杂交。' V. U" Q5 A6 T3 M
二、原位杂交
% M6 o2 b( {% [* i7 s$ J1、 切片去蜡，二甲苯水化，过梯度酒精，然后用蛋白酶K（100μg/ml）37℃消化15min。6 K) o5 @% g2 H( Y% I% m) v: k
2、 前面制备好的Y染色体cDNA探针用地高辛标记检测试剂盒做标记。' y: D [# |+ M& t& i. p
3、 杂交液在42℃过夜。用荧光抗体增强试剂盒（Boehringer Mannheim）可以在荧光显微镜下观察到地高辛标记的Y染色体，由异硫氰酸盐荧光素发绿色光。然后载玻片用10ng/ml亚丙基碘化物（Propidium Iodide，红色）复染，以使细胞核染色，加抗退色液和盖玻片。阴性对照不加探针或抗地高辛抗体，其它按相同操作。
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发表于 2011-12-4 02:45
