为什么病毒转染效率高，却不能感染相同293t细胞？

wangsandan0503

2011-12-28 10:38 上传

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近日包病毒，用pei转染方法转染，24小时观察荧光，如图所示，但是为什么感染293t细胞却没有出现荧光？请大家分析讨论一下，谢谢

Yedan

包的什么病毒，辅助质粒是什么，确定是能感染人的细胞的辅助质粒？- A- x& W9 S' R8 r; p
最后，说一句废话：LZ包病毒的时候加了辅助质粒吧。。。

rexhz

转染后收集的病毒上清的话滴度不高。这过程有很多因素，比如换液时间，转染完用的血清的量，质粒加入的量。
& W& m7 Y" Y% Z; M  W  r$ H你这个荧光很亮的话，而培养液上清没有滴度，可以考虑缩短转染完换液的时间，还有增加一些辅助质粒的量。
8 y0 \4 m+ S6 V问下楼主，你用PEI来转染是转293还是293T,我看到的都是转293的，
4 f, i5 A2 G8 D2 W6 d/ I还有能否提供PEI包病毒的protocol?

sizhengliu

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- w/ K: a. m( U+ F2 q& C- E- Z: B4 N' W" a0 Z
你好！转染前后培基中血清比例有不同吗？你一般用多少？

zzyhelixinxin

不知道你感染293T细胞后，多久观察的，我们一般都是病毒感染3~4天后倒置荧光显微镜观察感染率。你所用的病毒滴度是多少？这些条件都要考虑的！

cicadacjk

首先确定你包了病毒4 \9 w$ T8 W1 O8 p- s
其次确定你的病毒能感染人的细胞（单嗜逆转录病毒不感染人细胞）
: _$ v- z( e, v0 {' Y然后，建议你换转染试剂，我做过test，PEI包病毒效率非常差，远低于Fugene、Lipo、钙转（这三个依包被效率排列）。PEI我们一般用于瞬转表达

xiaoyurly

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% S1 L0 d' _6 e/ {* T
% E" h  L, _9 C7 E. F读了两次才弄明白是293T包出的病毒再转染293T无效率，瀑布汗~: g5 O4 e$ t5 H5 V9 l; Z. a1 ]
不知你用的辅助质粒是哪个？VSV.G是能够感染人源细胞的么？
7 y- H' F: L% V包装病毒时各质粒的配比？转染时病毒与细胞的量比关系？？* _+ _  D) C# {. j" \. F" n
有没有用这个病毒转染个3T3之类的鼠源细胞？& K& y6 ~/ G) j( x$ @# a; L" H
病毒制备需要注意很多细节问题，希望能说清楚些，才好从中找到原因

wangsandan0503

回复 zzyhelixinxin 的帖子0 l4 O3 W8 Z6 J

9 Z. Q. A: G! v# _& t4 i感染293t细胞，我们也是倒置荧光显微镜观察，您说3-4天之后才照荧光吗？

wangsandan0503

% ]7 C+ W# u9 B: R) a& B3 P
6 q7 x. Y5 i4 r  p2 R$ [- `2 N
回复 rexhz 的帖子! o! V2 Z6 `2 t$ y

# U* F- D9 H, X6 h( d下面是我的详细步骤，希望大家不吝赐教，谢谢。1 U+ F0 L: E+ R; n
1.        稀释质粒为1µg/µl( z" ]/ t( \! Z/ h- u. h" E* Z+ s
2.        按照包装体系rev:gag:mcs:vsvg=1:3:1:1比例分别加入质粒, o' U' u) w. H) C% t. I8 V  g
3.        加双无培养基
3 v3 t5 z- ?1 j3 c' y, L! w8 P4.        PEI4倍体积：质粒1倍体积# M9 x$ v) o+ u  {9 W) M" V1 G
5.        室温混匀，静置10min
8 V# n4 r7 h4 Z3 G/ {- Y# h6.        给293T细胞换液1 n) L6 ^, M" y; h4 X' P1 ]) a
7.        加入混合物于293T细胞（计时间）
- V8 f) x! G* Q' |6 r7 D8.        8小时后换液，换新鲜双全培养基
# {( }! i3 ^& `/ C9.        转染后60小时收毒于一个细胞离心管中  P: A1 U! F9 L
10.        离心5000转 5min( Y/ I- m3 `. A+ h0 T5 S5 Y$ ^3 ]
11.        用45μm的滤网过滤到一个个EP管中' z9 y/ F- |3 y% o% o; }
12.        加入500µl过滤的病毒液（上清）条件合适的293T细胞培养皿7 a$ o' u- ~- Q' G0 @
13.        8小时之后给293T细胞换液
2 d1 M& b$ T+ t8 K  L14.        24小时之后荧光显微镜下观察转染情况, `& ]8 C* E% F; a+ S

momocy

我也试过唉，就是293T细胞包装出来的病毒感染293T细胞，结果没什么GFP，而之前转染的时候GFP都是很亮的，也很疑惑