为什么病毒转染效率高，却不能感染相同293t细胞？

wangsandan0503

2011-12-28 10:38 上传

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近日包病毒，用pei转染方法转染，24小时观察荧光，如图所示，但是为什么感染293t细胞却没有出现荧光？请大家分析讨论一下，谢谢

Yedan

包的什么病毒，辅助质粒是什么，确定是能感染人的细胞的辅助质粒？
# n) m5 N, m7 W8 i最后，说一句废话：LZ包病毒的时候加了辅助质粒吧。。。

rexhz

转染后收集的病毒上清的话滴度不高。这过程有很多因素，比如换液时间，转染完用的血清的量，质粒加入的量。
% ], O( N4 P  x9 q# \! T你这个荧光很亮的话，而培养液上清没有滴度，可以考虑缩短转染完换液的时间，还有增加一些辅助质粒的量。8 T1 j* T+ ~! [
问下楼主，你用PEI来转染是转293还是293T,我看到的都是转293的，8 p% g- c8 w. A# i
还有能否提供PEI包病毒的protocol?

sizhengliu

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3 Y/ z. {' j) U) F1 E, c8 q
; C2 p0 X: A- Y* l# A你好！转染前后培基中血清比例有不同吗？你一般用多少？

zzyhelixinxin

不知道你感染293T细胞后，多久观察的，我们一般都是病毒感染3~4天后倒置荧光显微镜观察感染率。你所用的病毒滴度是多少？这些条件都要考虑的！

cicadacjk

首先确定你包了病毒
: E, d* S+ e* \其次确定你的病毒能感染人的细胞（单嗜逆转录病毒不感染人细胞）: |' N' j0 D. ?1 F; g
然后，建议你换转染试剂，我做过test，PEI包病毒效率非常差，远低于Fugene、Lipo、钙转（这三个依包被效率排列）。PEI我们一般用于瞬转表达

xiaoyurly

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/ y1 J: J4 [& A/ G# G" ~* @( I: Y: H2 H4 S
读了两次才弄明白是293T包出的病毒再转染293T无效率，瀑布汗~) z( W# L4 _+ T$ f5 V
不知你用的辅助质粒是哪个？VSV.G是能够感染人源细胞的么？' Q$ w6 C' Z% a. |4 H0 E  I- h: q
包装病毒时各质粒的配比？转染时病毒与细胞的量比关系？？
0 I# o+ ?- P) {; \8 F, N6 q5 H) s6 p有没有用这个病毒转染个3T3之类的鼠源细胞？
: t; x" ~9 o% X' `8 t8 P病毒制备需要注意很多细节问题，希望能说清楚些，才好从中找到原因

wangsandan0503

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6 I; f) `4 e4 N# E; c! H+ O' `0 W! K) z6 X# \
感染293t细胞，我们也是倒置荧光显微镜观察，您说3-4天之后才照荧光吗？

wangsandan0503

+ m8 |' m3 m4 n) A& q
: Y3 N# w2 W" Y5 l: g0 v回复 rexhz 的帖子
! v, x. k9 v  {- a$ F( F, \' B! T- u
下面是我的详细步骤，希望大家不吝赐教，谢谢。
: m. I$ I4 L+ R& W) _) ?1.        稀释质粒为1µg/µl
. r6 W* y# I+ \0 M3 M: X2.        按照包装体系rev:gag:mcs:vsvg=1:3:1:1比例分别加入质粒7 B8 I- h* p9 R/ F( q+ p
3.        加双无培养基
0 v) |( U" w7 z0 x+ U# X, W% _4.        PEI4倍体积：质粒1倍体积
- H9 q& O3 n! Y8 K+ i9 q5.        室温混匀，静置10min9 b  N3 Z0 y: V8 `. ]% o. J2 X0 @
6.        给293T细胞换液4 G7 i6 W0 X) Z% }- m
7.        加入混合物于293T细胞（计时间）
8 G; a/ E# h$ G8.        8小时后换液，换新鲜双全培养基3 x* `: S. J$ y0 U; `0 v1 m0 _
9.        转染后60小时收毒于一个细胞离心管中: T: y4 L7 g3 ?
10.        离心5000转 5min% K& i1 ]1 H' s3 B# `% t4 S
11.        用45μm的滤网过滤到一个个EP管中
. X2 }2 I9 w) M. z  _/ _1 L12.        加入500µl过滤的病毒液（上清）条件合适的293T细胞培养皿6 b$ `$ ?1 }* _! b" v3 b
13.        8小时之后给293T细胞换液
* K% Q3 Y, p, I. D. `7 g4 ~* ^14.        24小时之后荧光显微镜下观察转染情况: i4 D0 i4 [7 r+ J: v9 i' q

momocy

我也试过唉，就是293T细胞包装出来的病毒感染293T细胞，结果没什么GFP，而之前转染的时候GFP都是很亮的，也很疑惑