为什么病毒转染效率高，却不能感染相同293t细胞？

wangsandan0503

2011-12-28 10:38 上传

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近日包病毒，用pei转染方法转染，24小时观察荧光，如图所示，但是为什么感染293t细胞却没有出现荧光？请大家分析讨论一下，谢谢

Yedan

包的什么病毒，辅助质粒是什么，确定是能感染人的细胞的辅助质粒？
  V; Z$ `3 l& G; w8 H, ~最后，说一句废话：LZ包病毒的时候加了辅助质粒吧。。。

rexhz

转染后收集的病毒上清的话滴度不高。这过程有很多因素，比如换液时间，转染完用的血清的量，质粒加入的量。8 H+ @3 O. [* H8 v& p
你这个荧光很亮的话，而培养液上清没有滴度，可以考虑缩短转染完换液的时间，还有增加一些辅助质粒的量。
% }9 s. Q& k2 W7 k" H问下楼主，你用PEI来转染是转293还是293T,我看到的都是转293的，
' F. A. y- R9 T- c0 O还有能否提供PEI包病毒的protocol?

sizhengliu

回复 rexhz 的帖子
1 {9 u  g& b& }
6 R. y( O3 g5 P. B3 [你好！转染前后培基中血清比例有不同吗？你一般用多少？

zzyhelixinxin

不知道你感染293T细胞后，多久观察的，我们一般都是病毒感染3~4天后倒置荧光显微镜观察感染率。你所用的病毒滴度是多少？这些条件都要考虑的！

cicadacjk

首先确定你包了病毒
6 Z$ K3 c, a+ [' I, H8 v# P. k其次确定你的病毒能感染人的细胞（单嗜逆转录病毒不感染人细胞）
5 h0 J# {5 A( ^然后，建议你换转染试剂，我做过test，PEI包病毒效率非常差，远低于Fugene、Lipo、钙转（这三个依包被效率排列）。PEI我们一般用于瞬转表达

xiaoyurly

回复 wangsandan0503 的帖子- W9 v9 i; q: o

! g4 a4 }1 k" w- ]) ^读了两次才弄明白是293T包出的病毒再转染293T无效率，瀑布汗~3 u# y. }( W, l
不知你用的辅助质粒是哪个？VSV.G是能够感染人源细胞的么？
1 S. o6 x7 D& T% w+ E包装病毒时各质粒的配比？转染时病毒与细胞的量比关系？？5 l% o* o: k9 u5 j1 H+ w) o; t9 \4 v
有没有用这个病毒转染个3T3之类的鼠源细胞？0 m8 o# n8 [3 U, i- D% _
病毒制备需要注意很多细节问题，希望能说清楚些，才好从中找到原因

wangsandan0503

回复 zzyhelixinxin 的帖子
0 u1 c' z+ X3 Y( y) @
/ N7 t8 a5 q% I8 X% h感染293t细胞，我们也是倒置荧光显微镜观察，您说3-4天之后才照荧光吗？

wangsandan0503

. H# p( C/ K, o# Y7 _! E
! J) ?/ u3 m. u5 I) B
回复 rexhz 的帖子+ k: D8 Y* x# G6 @
; h& `' n+ i# N" ?! p- Y
下面是我的详细步骤，希望大家不吝赐教，谢谢。
. p" {+ M$ u0 z2 {1.        稀释质粒为1µg/µl6 d( ~- L7 ^1 T" M# f& F
2.        按照包装体系rev:gag:mcs:vsvg=1:3:1:1比例分别加入质粒
- b- }& w5 d- e* ~; ^3 X3.        加双无培养基4 ?- B5 s8 N4 {2 G/ X; P7 X) [( I
4.        PEI4倍体积：质粒1倍体积1 I7 b  q( l+ E
5.        室温混匀，静置10min4 ^' @% n3 C; }8 {$ P1 Z4 O  }
6.        给293T细胞换液8 \+ D+ l, l6 I2 _. \, y- H- Z, O
7.        加入混合物于293T细胞（计时间）/ W  L; ]- a( P/ \" \' ]( m
8.        8小时后换液，换新鲜双全培养基* q, z# H0 m$ J: _8 P" L
9.        转染后60小时收毒于一个细胞离心管中
# B  M0 Q5 N1 O0 [1 h' e7 Q; H10.        离心5000转 5min. s+ e. f" b, v+ `
11.        用45μm的滤网过滤到一个个EP管中! h% f* W% G( |) m
12.        加入500µl过滤的病毒液（上清）条件合适的293T细胞培养皿
/ P/ V; }4 o2 z0 o13.        8小时之后给293T细胞换液
% \0 ~, @( G. B8 X, m/ D14.        24小时之后荧光显微镜下观察转染情况6 e6 D7 C9 |$ k: v

momocy

我也试过唉，就是293T细胞包装出来的病毒感染293T细胞，结果没什么GFP，而之前转染的时候GFP都是很亮的，也很疑惑