冰冻切片DAPI复染一团糟是什么原因？

dilal

/ z- k7 q1 d3 ?. ]  R

7 o# T# J$ e0 x) h最近做冰冻切片免疫荧光染色，DAPI复染时老是背景很深、一团糟，无细胞核形态。具体步骤如下：5 g" f4 M, t6 `/ s% n6 D
1、取心脏组织，OCT包埋后进行冰冻切片；6 v* ^3 a. t( y5 `$ F
2、用-20℃预冷的丙酮进行固定10min，室温下风干；2 b2 L0 q+ y: o. s
3、PBS洗三遍，每次5min；! m! y- V7 U3 G) G
4、用3%双氧水37℃处理15min后，PBS洗3遍（每次5min）；# A: m' ^- p3 ?0 x! _0 x* A
5、用羊血清37℃封闭30min；
) d! T# W& I- y7 L+ W4 ?6、一抗4℃孵育过夜后，37℃复温45min，PBS洗3遍（每次5min）；
$ r2 p8 ]/ Q1 M) k7、二抗37℃下孵育40min，PBS洗3遍（每次5min）；* ]5 B' c/ y- }, u
8、用DAPI复染，PBS洗3遍（每次5min）；$ w# m; ~- C# j/ X7 @2 a0 Z/ [9 {
9、封片，观察
6 e8 A6 @/ x) ~# ^" @见下图/ H, h0 D! m1 Z

2012-1-14 00:07 上传

下载附件 (106.1 KB)

1 k% n. s4 y' d9 L3 l1 F! p+ a
前面也做了一次染色，当时是切完片子后约半个小时后丙酮固定10min后，4摄氏度下保存。3天后做的染色。步骤大致相同，多了一步0.25%triton X-100透膜处理。DAPI复染细胞核染色很好，背景也很浅。如下图：# X8 w5 K/ o& O

2012-1-14 00:07 上传

下载附件 (170.26 KB)

4 J- H. ~4 ~. D$ y0 I) k: b
问题：4 R& B  A: [# S' v+ B
1、丙酮本身具有通透作用，冰冻切片丙酮固定后还需要进行triton X-100透膜吗？
3 F- \4 V* W3 ]  m0 L2 W& [$ o7 `" b2、DAPI复染不成功，是否与triton透膜情况相关？3 D3 I& X& e, x) X0 o8 S5 B
3、冰冻切片免疫荧光染色规范的操作步骤是什么？

luoziwei

我猜你是封片的时候移动切片了，应该是物理因素造成的，不像是化学处理不当引起的。

dilal

回复 luoziwei 的帖子* N' P( @% K  X/ s$ e# O+ x
& ?# _. n9 R4 D
谢谢，很可能是，我当时用甘油封的片，很滑，移动过。请问你一般是怎样封片的，如何不让片子移动？如果不封片，可不可以？片子好像很容易干掉。

dianying

回复 dilal 的帖子
( |) q- l: P2 z! G: W5 W; i7 w9 E6 ?  j2 B& V7 W
封片子用35ul 就够了（不能有气泡），多了最容易滑，而且浪费，用稀薄纸包上，在室温中过夜。第二天用透明的指甲油用刷子把四周刷上，放2-3个小时就没问题了。

moluxingke

我们做IF时省略去了通透的步骤，其他的步骤你的大体相似，只是固定时我们一般选用甲醇，抗体选择4度过夜或是37℃一到两个小时。- C% x* f6 |( _
看你的片子，感觉像是封片剂中混进了其他东西，对焦似乎也有问题，有时候出现这种现象和切片状况也有关系，特别是组织冷冻过慢出现冰晶，很容易导致组织结构变形，染色不均。我们冷冻组织的时候，将组织包在OCT中，然后在液氮中冷冻，主要是防止那些含水量较多的组织因为缓慢冷冻在内部产生冰晶。
% R/ K6 p# r" q: v- q; S$ y另外，我们切完片子如果不立即使用，一般在-20℃或是-80℃存放。
. D3 A# C- H/ R- V9 T  ~5 a8 z一点建议，仅供参考。

dianying

回复 dilal 的帖子0 I. L. c  k0 j% I

' z4 V' V/ v/ g, i9 J# ^如果你的产物很好染，你又不想片子染后太脏，你不妨试试。
8 Q; j; ]* X8 _我师傅教我的1x pbs洗5遍，分别是5，5，15，15，5分钟

luoziwei

回复 dilal 的帖子5 j" _* H2 ]$ C. |1 }) t

% R: O& A5 b: U8 g* d" z; o; i) v在每个组织块周围加1滴甘油就行，然后盖玻片从甘油一侧慢慢向另一侧覆盖过去。不封片的话对个人的拍照技术要求很高，要求在短时间内迅速找到蛋白，而且还要拍的好才行。一般还是封片的，为了保险嘛

mansnoopy

建议1，改用PFA固定。2，染核后在水里稍微荡几下即可

dianying

回复 mansnoopy 的帖子+ ?( M; {8 l5 x) n1 R
/ y5 T4 p* o2 Q1 w
建议你动物先灌流，拿4%PFA固定再包埋、切片。冰冻切片固定后需要进行triton X-100透膜打孔。0.1%的就可以。

dilal

回复 luoziwei 的帖子
) s3 B1 F4 [# B" D, ]4 T$ J7 C5 V+ D* e! ?0 X: j" M
我也是加一滴甘油后，将盖玻片缓慢覆盖的，但是老是出现玻片滑动，不知道是不是加的甘油太多了（1ml枪加一滴）？而且感觉蜡块画圈的地方非特异性荧光很多，不知道你是如何处理蜡圈的。