冰冻切片DAPI复染一团糟是什么原因？

dilal

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最近做冰冻切片免疫荧光染色，DAPI复染时老是背景很深、一团糟，无细胞核形态。具体步骤如下：
7 D! R7 E; f8 d% P$ n1、取心脏组织，OCT包埋后进行冰冻切片；
+ c! G- E3 W: p7 R( z2、用-20℃预冷的丙酮进行固定10min，室温下风干；' n5 f/ C/ B; x( f
3、PBS洗三遍，每次5min；
% z+ N) m8 u" D6 C7 j4、用3%双氧水37℃处理15min后，PBS洗3遍（每次5min）；
' e" K) n9 f! @) l' k3 O8 U5、用羊血清37℃封闭30min；
2 m. x$ F$ S% p$ I3 i7 W6、一抗4℃孵育过夜后，37℃复温45min，PBS洗3遍（每次5min）；
9 R5 S# f7 u# \1 T7、二抗37℃下孵育40min，PBS洗3遍（每次5min）；5 K" j7 K0 [/ y" m. P* j7 f+ q
8、用DAPI复染，PBS洗3遍（每次5min）；& C( e7 h# ?% W
9、封片，观察
; y: q* c3 n0 t7 q" u5 p见下图8 e* h& r) E1 H1 z9 ^0 k

2012-1-14 00:07 上传

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9 V3 P" x1 b9 y( J4 y' c# K
前面也做了一次染色，当时是切完片子后约半个小时后丙酮固定10min后，4摄氏度下保存。3天后做的染色。步骤大致相同，多了一步0.25%triton X-100透膜处理。DAPI复染细胞核染色很好，背景也很浅。如下图：1 [. m& h+ V7 @" `  x0 b

2012-1-14 00:07 上传

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* j2 m$ e( h4 |4 R8 e问题：
' t3 m* C, r; c$ l# ^9 ?2 c8 |1、丙酮本身具有通透作用，冰冻切片丙酮固定后还需要进行triton X-100透膜吗？
5 \& F$ ?* i# J$ J2、DAPI复染不成功，是否与triton透膜情况相关？  j+ Z  x2 B& W5 h! q6 d0 G
3、冰冻切片免疫荧光染色规范的操作步骤是什么？

luoziwei

我猜你是封片的时候移动切片了，应该是物理因素造成的，不像是化学处理不当引起的。

dilal

回复 luoziwei 的帖子# h5 I6 d$ p0 n$ T
) W8 H1 m3 s5 C# ~% A; p
谢谢，很可能是，我当时用甘油封的片，很滑，移动过。请问你一般是怎样封片的，如何不让片子移动？如果不封片，可不可以？片子好像很容易干掉。

dianying

回复 dilal 的帖子
5 Y4 m* b( L. Q7 d- O# A
1 j3 {% g3 U1 K封片子用35ul 就够了（不能有气泡），多了最容易滑，而且浪费，用稀薄纸包上，在室温中过夜。第二天用透明的指甲油用刷子把四周刷上，放2-3个小时就没问题了。

moluxingke

我们做IF时省略去了通透的步骤，其他的步骤你的大体相似，只是固定时我们一般选用甲醇，抗体选择4度过夜或是37℃一到两个小时。. `( K# x( q; k4 `+ C6 E. o
看你的片子，感觉像是封片剂中混进了其他东西，对焦似乎也有问题，有时候出现这种现象和切片状况也有关系，特别是组织冷冻过慢出现冰晶，很容易导致组织结构变形，染色不均。我们冷冻组织的时候，将组织包在OCT中，然后在液氮中冷冻，主要是防止那些含水量较多的组织因为缓慢冷冻在内部产生冰晶。$ x" g; I) H; e7 O6 K3 R
另外，我们切完片子如果不立即使用，一般在-20℃或是-80℃存放。+ V7 a' Q) r# l, [* N9 u
一点建议，仅供参考。

dianying

回复 dilal 的帖子
: S" t- `/ E/ a2 X9 E& h6 h0 q; d8 ]  i0 x* q- d: Y) J: r) z
如果你的产物很好染，你又不想片子染后太脏，你不妨试试。
0 p* ^7 o1 Y- `4 n  p) a3 S我师傅教我的1x pbs洗5遍，分别是5，5，15，15，5分钟

luoziwei

回复 dilal 的帖子! O5 H5 o" I& D7 x  o, M

1 M7 i4 N9 r% v在每个组织块周围加1滴甘油就行，然后盖玻片从甘油一侧慢慢向另一侧覆盖过去。不封片的话对个人的拍照技术要求很高，要求在短时间内迅速找到蛋白，而且还要拍的好才行。一般还是封片的，为了保险嘛

mansnoopy

建议1，改用PFA固定。2，染核后在水里稍微荡几下即可

dianying

回复 mansnoopy 的帖子, c1 z$ V9 r6 `! I7 x" P$ J

) ]& o# J9 Z+ i0 B: {2 G" z建议你动物先灌流，拿4%PFA固定再包埋、切片。冰冻切片固定后需要进行triton X-100透膜打孔。0.1%的就可以。

dilal

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8 A' l! d; `' m$ s. z. k" \( S- Z. x
我也是加一滴甘油后，将盖玻片缓慢覆盖的，但是老是出现玻片滑动，不知道是不是加的甘油太多了（1ml枪加一滴）？而且感觉蜡块画圈的地方非特异性荧光很多，不知道你是如何处理蜡圈的。