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造成支原体高污染率的原因为： # k t1 `# z2 w- c$ R& p
1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） 6 d: b, z/ x4 i
2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 & T4 v4 q8 h' {2 m' u: p5 R3 B8 [
3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 ( C$ O8 R6 P0 n7 X" b
4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染
$ z! I$ F8 }4 Z$ |' p 5、研究或操作人员忽略污染问题
/ H$ y5 N+ C1 D, }# E; q4 y% b" h; y9 O2 @0 ~1 H% f
支原体污染了来源：% W' X1 {+ N+ T* t" x9 o* H
1、已受污染的细胞
) ]- T5 h, A p1 `6 A9 f 2、操作人员的疏失
8 U* }. Q( T& {$ H& ` 3、已受污染的培养基、血清 # d' x2 r) D) z( L( D
4、操作环境不良、实验器具不洁等
$ z8 \. d: W- k8 u( {: i* _' K9 X8 l9 C
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。! T4 t3 L/ S, P3 m
# A4 M( ]8 b3 @ r去除支原体污染：
* M3 y ]* e$ } O, D7 j. _ 1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer） 8 A3 |* u; g9 X
2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine . r: p' B1 _" V# T
3、Anti-sera 4 E) c& q: N$ ?3 \3 Z1 \
$ L5 ]2 q4 y& {- v3 u3 q" p' p- M; k
预防与控制方面可从以下各点加强注意：( i! F. s1 o( V) y' @2 Z3 c
+ U. D+ t( p0 k" ]" V+ K* M4 v# k设备方面： 7 a7 r4 b# U7 n# m! ^+ a
1、使用已作支原体测试ok之细胞株
" y9 [6 E1 h# m 2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
9 _% i8 {. _' \: U9 `+ F! z 3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞 9 q* _; [3 k3 ]/ L$ ?& n
- B& ?$ o! r7 v检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。: H m, V h8 g& L! |% {
: x; T- S9 q# U3 w' c- t实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
4 B6 F7 U- d, P# @& ], G! u& A% E# Q1 O& v3 ^0 ~9 {
有关支原体污染之问题与回答：5 a1 v+ ?5 A0 Q z2 @ p, H
0 n2 K) e- j3 w9 P1、应如何避免细胞污染？
; J6 g' \% [4 S$ T2 B0 g 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。; ^( V; }# N2 z n7 T/ `0 o6 }
" P, ?$ J$ [+ x% l- K) @: \ B$ c. Z2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？
! V. ~. P0 q' O$ \. K 直接灭菌后丢弃之。
0 j( v$ @4 E7 O0 y, F7 g4 y, M" G3 h
# x. O. u5 N: N( b; K5 ~% |; J3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？2 v3 Z+ T! c% n8 t
不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。$ z) y0 a! u" |/ V3 g
/ y5 Y7 C1 {1 A$ a
4、支原体污染会对细胞培养有何影响？
: c5 n) ?! g% u0 [; P. k 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
3 B0 W! u4 V, w$ @& c& Y5 b& a0 F! J
5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？
H7 D6 K6 A6 z7 a$ Y* }4 B9 z 直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 ! l: l: h' j8 d3 O
& ]$ w; o2 \6 P
支原体之检测：
3 D) n. y/ c- ?/ l* s- e' h7 [6 H9 V* Y4 { x
直接培养法 ( W8 b- I$ g! C& c
/ M' }. ^! O5 c) v8 l) B7 W. ^ 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
5 `! F, S5 N' Y1 i) _
8 G& u; T/ O3 ]9 p特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。1 K. P. L- h! _ a/ C( O. L
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缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。 ' f1 S9 x9 W7 h; h
# ?, I C4 c8 |8 L# D材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。） - ]" e" S* W% d- X% v
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培养基制备：& n" U. D+ Z* y( g' ?- r0 |6 d
' ]1 \/ P& I* s8 H) X+ r
基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
1 q% |' f/ m" C. i
' G2 W/ J( ^7 m' } J8 X. \( T4 b# i· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
/ X' x) r; a# o' Z. z1 X* d8 a8 A1 f' o) A- ]2 s
· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。 9 Z$ G) j- L; u, U5 t) }
1 m0 K" {8 W& H4 A· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。
) f2 C2 l! p+ q3 H. B9 A4 ^# ]6 R; ^7 B2 T' U1 [" D x
步骤：& z% F4 [5 x9 z/ d, ^- G, ^
$ ~) D0 A% X% _! R7 Q· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。' Q: M) ]! @5 M* d, d& d
, s. T) @, f/ o/ T3 t1 c2 j* m· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
& U. }% o; X& N/ @4 X, P5 o: k
h3 e# n7 W& p, C2 r$ C2 x· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
( O9 v1 i2 r; _1 }+ ?' t
+ ?. }+ }; O+ s& ]8 [( P. g结果判读： & S6 f) g2 x2 n W- Q0 A& k( H
% O7 q" H* P G6 C* ^8 }/ S+ ]1 c
· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。. L* H# E. h" R
/ N$ b! r% M9 c% J$ }; c
· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。' \- n$ z+ r6 Q6 \3 {
( X0 { ^5 x( f8 o· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。
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总评分: 威望 + 2
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发表于 2012-1-27 13:39
