|
 
- 积分
- 361
- 威望
- 361
- 包包
- 1970
|
回复 cbjonathan 的帖子# x& O! J$ @3 W9 i7 y& e
0 M, H: ]$ [% R造成支原体高污染率的原因为：
( J5 X3 h/ a1 E$ L+ p* U, f, D 1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） ; Q/ K8 s8 q9 _( I3 j
2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
9 B& a1 A; Z2 J/ W) J 3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 ) _' v# Y4 X/ t1 U. H( S
4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染
- E" @* j% k6 f1 E6 ^0 i 5、研究或操作人员忽略污染问题5 i& W4 B5 w# ~, [' j- H
0 L5 b* d }; f& t$ f; s. G! u支原体污染了来源：
( Y# Y( R+ E) t( _$ L" N3 H% M 1、已受污染的细胞 2 I/ K& t+ b3 Y4 W
2、操作人员的疏失 . c+ m, ^% ]/ {& P' ~1 b
3、已受污染的培养基、血清
) |& r2 E/ l6 G/ T 4、操作环境不良、实验器具不洁等
2 L2 i9 M; O& W4 M
% ^! t+ u3 t9 ?* R( o由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
9 ?8 T% i( D# R2 [ t& P
: l6 M! O3 A. { l& V b去除支原体污染：
; ^; s5 [1 O4 h+ O7 L+ r' i( L( M) ^ 1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer） ! d2 T$ T+ J8 ^) H4 J0 E
2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine ( E+ T4 g( L; C0 [ Q' D" w+ Z0 G
3、Anti-sera }" t% @4 O: L* s4 g: w# r
' I0 W" G) g. g2 V. p预防与控制方面可从以下各点加强注意：
4 U4 g. p3 D" s& J
9 ^0 {$ i% @) ~+ |5 \5 w4 d4 F7 b设备方面：
! d. O- H6 I5 f+ R! ] 1、使用已作支原体测试ok之细胞株 5 }6 u0 n: j L0 a
2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
9 {6 g% J) q ]. w4 ~ 3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞 ) ^1 d' v- Q$ \) Q' `! q. ?
. H) }' V, O& [- m检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。# ?+ F) {* }+ _6 Q' d0 T0 [
; ~) n5 ]( l* j/ f. m实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求& L v* b) g0 c# D/ A* ^
( D8 L7 w' k' @9 k3 a8 z. M; o有关支原体污染之问题与回答：
$ u, y! F D0 u
: A+ K- o6 v6 T# ^5 G6 j1、应如何避免细胞污染？
& B! i: d" e1 Y# f 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
- ^: F5 H% C& t% Z5 U1 Z" ]7 w1 j* }9 [2 k A
2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？3 _/ A/ b f/ l) L- {
直接灭菌后丢弃之。+ k/ v0 w4 t1 @- T4 v4 l
" W; C9 D; w( v+ a% `# ` c8 i8 Z
3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
6 V9 ~8 T1 ?( f* G' W: y1 q% q a 不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。& [3 p; V i6 j9 t" P
$ O X2 O; i9 |; d6 |; J4、支原体污染会对细胞培养有何影响？
' \+ t F! p+ \4 T1 L4 {% _' E 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。3 q, a5 ]2 V8 ~) ?+ T4 F
! E( E# Y+ H5 Q8 B5 R) G7 F5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？; f7 l7 ]6 ]+ u
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
) D) O0 K/ O( _
* o) @" r: E' Q" ^% |" U$ F( Z支原体之检测：
0 D+ I( i1 _. c" S: T, d0 V+ c8 v1 z: I3 z7 r
直接培养法
h2 J4 ]" Y! q' o) a9 D0 @) o2 Y! o0 q+ x) A+ j) p" P" h6 O: S- C
原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
% W$ W+ h4 y3 ~4 s! P: p7 h
6 M# a/ z9 @9 j特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
. g1 I% o6 M [- D) I! n. E/ b( Y0 f2 C2 E
缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。 % V+ c6 b9 i" d4 ]4 N2 t0 u
# {& R, w8 T. b" O
材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）
/ P8 x+ Y: W- F9 c
/ R1 h9 c1 ~1 t培养基制备：0 P$ t5 }- Q/ i K3 E
9 g3 X7 x( i% e基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。2 v; j5 g& y1 b% w+ c; j8 o( s1 j
9 ~, ?; X+ x3 l! b0 w( |, X· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
$ [$ g1 w3 E1 i4 }% o# d
- g- O$ p- E5 u& a" d" \5 W* W· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
( C* h( [8 S7 k' ?" ^4 Q9 v( a( y" P0 U+ N& ~3 x2 F
· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。
y) k3 t+ T2 V3 D5 U8 G) N7 a8 P. E. N
步骤：' G/ J" a; O3 ^
: G5 F1 T0 M) u _6 j
· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。; x; R; B3 x, X* Z2 u" L0 }2 f
, N! ]5 T& s( _, i, I( T! Y
· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
- f# r/ ?2 h( ]. p% I$ @/ m) [% v; z G9 g' A' e: m2 j8 \4 ^% Y5 |! |6 n
· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
' }' w+ m4 S5 X3 a6 [* u5 s _( L9 f6 _& `% f
结果判读： % v: I* m& A9 G+ w6 a! \, }
2 T3 a! i- Z/ Q! H1 d3 W
· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。3 G, ~, F/ ~4 T; Z# ^; p& q) e' M
: Z8 P' `4 ^4 m# A5 Q# y, r· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。4 h% q& ^5 U# @/ L/ `, O0 t
+ U" M z( E# e7 C) b. `( a$ E
· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。
9 B1 q) ^% `* ]5 b0 j1 x/ S6 J3 N5 k" i1 r; e% M' ?# n6 x3 ~6 p
|
-
总评分: 威望 + 2
包包 + 10
查看全部评分
|
发表于 2012-1-27 13:39
