|
 
- 积分
- 361
- 威望
- 361
- 包包
- 1970
|
回复 cbjonathan 的帖子( ^9 }5 J% r8 f2 p) |
: t+ V Z; N" N7 c
造成支原体高污染率的原因为： ' M4 X9 _, ?; O* _
1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） " E; V1 R8 K6 E N% @1 i
2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 # S) ~7 v5 D" t: e' N
3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式
* x3 d3 F+ Z% b5 P! u8 K, Q 4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染 3 F" D8 @$ [8 k" z t
5、研究或操作人员忽略污染问题1 ^+ s3 o7 ~5 b! v; J
, {6 `9 r1 S# N# n$ ?( R2 ~6 ^支原体污染了来源：
# s" g0 J' i; Y+ k( B' k 1、已受污染的细胞 " ~4 q9 Y L: _; ~- e3 m* \
2、操作人员的疏失 4 h& K& s2 a5 D1 k
3、已受污染的培养基、血清
$ E9 _9 ~, g* l3 m% X 4、操作环境不良、实验器具不洁等- m4 X+ Y/ x! d$ G1 m8 [2 I" _1 U
& g- L$ C: x/ G/ p- u
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。4 Q5 w0 s1 h9 e- ^2 o
: y3 n5 B" G! Z! f" s5 N$ b去除支原体污染： + L# r, a$ o: W7 A
1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
( N3 E* q8 c8 k" d$ a, n8 R 2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
# @: l, K: a0 J1 n+ X 3、Anti-sera , _; Z2 o: R! \1 e
% Z/ e9 E$ l" Q7 d" b3 u" I# L预防与控制方面可从以下各点加强注意：5 P9 Y0 ^; e7 F; a3 \( g
! w" P; {- p1 U* m9 {设备方面： / S3 c( s- \9 b3 J- O
1、使用已作支原体测试ok之细胞株
0 T3 {- `0 f! [- `* s6 u) h 2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
) K# M8 {. u" a3 B) {5 \( k 3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞
2 I8 ?- ]6 C% R; i# |# k
; i0 ]+ c# c( r$ ^检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
* _* Y5 n& r& w- b
; B1 S1 L# r6 `/ r, H实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
" e4 a- \% ~( w& ^# w
( n, c; B2 w' h5 ~有关支原体污染之问题与回答：1 o1 e% I8 j4 ~: v- i
8 o' o, F2 t$ R" J! k K+ B" a A
1、应如何避免细胞污染？
2 x! W5 L. u/ U; t( q- z 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。4 [; R9 `! X+ u; J3 N# @, T
. q; t% l0 W4 S( E& T/ h2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？
5 x! v: l9 i' Q+ ` 直接灭菌后丢弃之。
+ S$ x7 t$ F; f! @; N6 u) T. H
* R# R5 [ g: U- F3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？8 [1 G9 J7 A. q& N% `$ D- N4 I$ u
不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。
- T' ]2 d& B1 B+ v$ X* C+ {$ ?, M0 z0 k# x7 ?% p) `( v( F
4、支原体污染会对细胞培养有何影响？
4 y0 c; G$ a/ t+ t6 V4 ^ 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
" l6 @: ~: S. W$ t @* b6 B# a3 @. H$ g
5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？
b, w7 n; M1 k0 T# `' I* }. t: a 直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
5 d; ?+ h; g& s. [% _# w& l
4 p% N- { ~8 r支原体之检测：
7 z4 s1 q7 p" e6 V) h+ U b; J* i
8 M% ~' N0 X3 \& }4 T) P0 ~直接培养法 ' _- I+ e. X% Y0 n8 x: s8 n
0 T1 M2 C. Y, ?
原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。5 h7 c: }4 T" p* P
) L/ c) c% y% F0 J; C* e/ Q特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。$ z1 j1 h( W% u. e! D" M, X
. L g% h3 S! T; ~' M- D
缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。 Q" t- _, o# X. a' S& d& ~) a
# \% l% i% o- q1 Y ^. Z
材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）
1 x/ | l* b) v5 C' _5 D5 K3 I k
7 n3 j2 [* ^. g* X9 f9 z! D培养基制备：8 ~" j) w7 p5 b4 a* a I5 {
8 N, Q, G6 H. T i
基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
4 t3 |8 A! w/ _7 a) o! l
+ j4 t7 W4 n b3 k3 d· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。 c& i: R( @9 u- q/ e5 h
$ |% A1 ]7 p" A. i
· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
0 Q% Q! c! d( Y& \4 J d1 Z8 y
) K: k: b% F+ z: Q· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。
c& X1 I( t: F* l" L: a# z8 y& ^4 W) q% C7 h7 S2 i
步骤：' N/ j# C$ W8 @3 W2 ~
' Z$ d. q6 G& N; F· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
* D; z% |' X. u5 \; N9 Y
3 q H4 L5 P* R8 U· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。, G# f* L4 t% Z4 |. H" ^
) m7 h' W* e. }
· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。0 b; L4 P9 w0 J7 B7 F0 R/ }# u
9 {6 h# c! j! \# o0 L$ B T
结果判读： ; Z$ q1 L7 h& g; @9 o9 E
8 c" h4 L6 {7 n) T9 V( g* A0 G! P
· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。
! d4 x) F8 u3 S4 {& P- T2 [& ^3 F& m1 O |
· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。8 x I8 D. g# _4 T1 T4 ~8 Y
/ f$ L) N! J% V' p; ?- O- P
· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。
' o3 g3 k6 }+ v1 Z( K0 @7 D
3 `7 z. w: `$ d1 }/ C* }7 a |
-
总评分: 威望 + 2
包包 + 10
查看全部评分
|
发表于 2012-1-27 13:39
