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回复 cbjonathan 的帖子& t- U1 o& s) r6 w
: q9 f' b7 x7 M造成支原体高污染率的原因为：
: @3 {2 v/ U4 k/ d, c$ e/ t; ]" B 1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）
" s1 }0 L: G# t0 o# d6 O0 g 2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 7 J' g" h) x9 o$ B+ M& K4 {+ m
3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 . [( n, X9 t' H& M/ C0 |
4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染
9 T+ T$ e% V) ] 5、研究或操作人员忽略污染问题
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支原体污染了来源：) h0 U; `1 n* y) A* y- ^4 V
1、已受污染的细胞
; ?# C- v0 s1 Z% W' b 2、操作人员的疏失 + U* w- B- V" v, \
3、已受污染的培养基、血清
( ?, [) S$ j; b/ ] u2 V/ N 4、操作环境不良、实验器具不洁等
, @* X0 P% u' u7 ]. i# L" U
, ]1 I S- `9 x- z L( \; `+ y由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。 u# n8 b8 d) s. R2 a2 N
" p" j5 H& ]3 k5 J2 Z! l: D0 @+ P去除支原体污染： 0 K' Q3 ^, I E+ u' Q# c1 h
1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer） 1 }) m8 |# ?( N3 m, z- P0 |, K* X
2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine - ~* _; G1 \9 [% K! B
3、Anti-sera 0 P* B, z/ S }
/ c4 }/ ]; l2 M7 i& K' U+ u预防与控制方面可从以下各点加强注意：
6 g3 \+ Z$ x, `: d, B" o. x& j2 W4 H' y
( n1 P# r7 \( ?设备方面： 6 I5 r9 i& C; \: h, I
1、使用已作支原体测试ok之细胞株 ) i! J! A! A, k
2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞 ( b; I" K9 A$ @$ g
3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞 - s4 {- L5 _+ l* J- [
, [! z j) E- g( i4 b3 C; w检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
2 E9 o0 J0 S. b7 k5 z& t. R# I6 t2 P. O% M6 N6 n
实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
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* t6 M/ f, ]* k8 a+ p. `有关支原体污染之问题与回答：) P3 B* @) Y$ d: U0 H4 D8 U! w
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1、应如何避免细胞污染？. N) k$ a) ]( ^ K
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
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2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？
. M. v7 v: U5 V$ h' c5 S( ` 直接灭菌后丢弃之。
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3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
% a L' s, | X4 d$ }% |2 _ 不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。' g. P _- I' }+ {9 v3 v
1 a3 K7 s& h' ~/ t9 t4、支原体污染会对细胞培养有何影响？( u1 ~' B( z# C# O7 r1 M0 w* x
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
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5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？% A" b% S# g6 I) p
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 . e8 f" s$ a, _7 n7 h
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支原体之检测： 9 b- B+ r# Y' e
, x, _+ p2 x0 H' z4 b: l: n
直接培养法
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原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
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3 r. s8 V9 B' C9 ^2 W6 a特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。* n6 X6 h4 u8 R* [& U1 J0 h
% H9 i7 t' z+ L7 W( o+ B! ?* V% z9 p缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。 $ ]3 L4 [; e) E
8 G) v1 b9 i$ ~材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。） % e% o+ R1 J/ b% V" C
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培养基制备：% U1 `' B$ ^' C9 i) X7 v* R
+ Y3 r. T6 x% h) n# p) ~基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
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4 N+ e5 A- n+ N" r k6 d· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
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· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
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5 n) U" p2 w. p6 @9 S% W· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。 % {6 ]. T9 K; ~% i$ [9 M( K
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步骤：
% t/ D' C6 O# C9 V. e6 s G7 l8 M; t3 X/ X3 y. f6 w
· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
1 N+ J8 |/ K# \; r y8 m2 e( m2 | P! D& C) H4 \
· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
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· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
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结果判读：
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· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。2 Z/ m; |2 ~& B3 R$ ?. ?" C
. m( ?4 ~& m! S, Z% N2 ~
· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。- n' Y U# O) f) j: \0 C
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· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。/ l. q4 \+ b5 p( {$ N: l$ }7 d. s
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发表于 2012-1-27 13:39
