|
 
- 积分
- 361
- 威望
- 361
- 包包
- 1970
|
回复 cbjonathan 的帖子4 ?* ^, ? {* E& U+ e+ [) I% f D
" U# H& }4 K3 p9 m4 H1 Z造成支原体高污染率的原因为：
# Z( o' C) E1 {3 D7 O7 X 1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） 0 ^8 O; C2 L3 L! B$ C( I# Z6 w& t
2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
! _4 H' {: N8 h+ n 3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 " [. ^0 ]+ l% V# D9 t# Q2 [
4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染
1 F* z0 w" c/ ?8 _9 c ] 5、研究或操作人员忽略污染问题
1 u1 U) f" i' l! Q1 `* q
3 X7 h; R- T+ b/ Y4 X) L; R支原体污染了来源：8 ]# r: x; x0 S
1、已受污染的细胞 ) h& v$ Z) u; t) ?8 v
2、操作人员的疏失 " r* @* {% ~8 ]; `% ]3 q
3、已受污染的培养基、血清
* L3 }1 ? z6 h4 @* [3 h 4、操作环境不良、实验器具不洁等 r+ u; L- k" F0 G& J, D# r% b& T; g
; p$ H" U( D( Z- ?7 U) L3 [# c
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
6 r8 f& F5 p! ^' y- j) i8 H" T7 q6 j
: R5 N5 m( f7 y去除支原体污染：
+ a9 G" I3 O v) ^9 m6 g 1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
' K0 b/ e% m- |( h8 F 2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine 1 ]7 W5 Z4 I& y# t& e+ i- [
3、Anti-sera
6 d9 {$ p* ^* p8 y- ]$ E
( k- d, m6 D3 F% a预防与控制方面可从以下各点加强注意：# ?7 Q1 V- }+ m7 ]
- i# K4 E/ c9 [6 w3 }' L设备方面：
) s6 ]! d! _! R$ M 1、使用已作支原体测试ok之细胞株
$ H4 a' g# l. E/ a6 F 2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞 " z1 ]7 v$ {. m( S
3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞
3 k5 V1 f; S0 o7 O% w# m1 I1 c7 a
X7 n1 ~0 q3 L2 [检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
$ J; _! x' s! ^) u
2 H- h7 _ Y2 L9 h2 t' ^0 D) L实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求% c( D6 Y* M# W: K
?5 U: p3 |* ?: Y
有关支原体污染之问题与回答：
* Q# t# z# S$ ^! |3 p! K/ [3 k, ?9 R0 V8 M
1、应如何避免细胞污染？
$ A" U( v$ \- Q$ F0 \' H 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。" f2 W1 g6 f! h# m# l& ^) R8 O) Z8 T
) d. D2 f( ]" J
2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？
$ N1 I; h% J T% V) | ?3 ~* ~ 直接灭菌后丢弃之。
+ n5 u$ A/ Z" d$ |- |& z2 `
! Q0 h& x0 a1 |6 u- {3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？. V1 f9 d7 g. _
不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。5 d. v4 L5 x+ M1 t4 ~/ F- O
" ]6 ?+ v+ t; e2 N5 g: u4、支原体污染会对细胞培养有何影响？$ P& z8 `7 Q, L
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
! {: M* {& L9 ?7 @0 `( }! p8 z3 X- m, n9 _# J9 h- D
5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？& w2 W' a/ q7 i# x5 u8 e: F4 D
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 6 L* T. t. S8 g2 T6 @
- G$ g) |# }" t7 O, `支原体之检测：
% S1 n1 `9 r# [# U+ q3 T j1 `5 \$ B. N& U1 v+ g5 U! Q) k
直接培养法 ( x S/ X1 S7 s" |8 n' }
( ^4 e: e, p- f0 g 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
3 U& s- L6 {$ S1 i! Z1 D" R, i
$ L7 v# A5 Q- U# Q特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。( A* ^+ d' Z- J1 N! |) d8 L6 M& J
1 V7 o: p( q) F3 d) Y& e
缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
3 [4 b1 ~0 j7 S7 G' b
3 r# k F) ?1 N5 Q8 D3 _2 k8 S. f3 s E材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。） _; j3 P+ e1 [3 x( q% S
+ H4 ~; L2 v$ [0 N
培养基制备：$ H1 N: K' e' y1 j1 f0 ]
4 V& y- j+ ?! l) v3 L* ]$ z4 r
基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
5 @) u6 @# t9 y- T! d; ^+ D. E+ T. l. Z
· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。 , T0 J- H/ K7 F8 g
# j) A) }3 ^% a" p6 Y, o
· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。 + h# n7 I2 o( R- |
$ n, H5 i3 X( K7 X8 X5 V' G
· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。 - O1 R9 \5 \0 i. t
9 }0 G( t' s: h. i& q
步骤：
# y, J3 Y% [! h; P- Y9 d7 C: E( B8 X+ r" [1 [
· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
4 Y* S1 S. J" F1 o3 u W6 b2 F- q5 z9 q9 b% a5 \" ~8 y
· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
$ R/ E* [. y q/ y8 V3 U
. g; m( _5 N8 Z: w$ T% Y· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。+ d4 ^2 V6 M/ A+ E. [4 G
: e5 l3 T) z% Y- y6 e, x
结果判读：
5 X6 ~' l$ ?0 }+ O$ H4 B
o. m- t+ B& D8 i4 @( Y3 Q· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。
$ b0 L( f& f0 t6 F8 ]# t9 k
7 I' o4 }6 r! z1 ^# t- _· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。
6 u: L& C8 Z" i2 }- O) d% `. m4 E1 k* _0 t2 R' Q
· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。
4 O& O( ?' d% U' i1 E( u/ i1 V3 R3 @7 W0 G2 m
|
-
总评分: 威望 + 2
包包 + 10
查看全部评分
|
发表于 2012-1-27 13:39
