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9 i p) {/ G3 K造成支原体高污染率的原因为： 2 s g/ K( J8 K0 n' d) x. B
1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） 5 f) t$ e1 X0 F) M, E6 j% J
2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 ; d: ^5 {3 y& V! y9 L3 _
3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式
, V) v0 Y) i3 {8 a 4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染
1 K9 Y3 ~ m# O& o) Y 5、研究或操作人员忽略污染问题7 ?& b6 T3 p" U# o9 h! w& g
! G- o; E2 `8 [: Q0 g- ]0 s支原体污染了来源：
3 R4 d6 O2 q/ X. \; B5 Z2 s( J 1、已受污染的细胞 , X& A+ V5 S* f7 q) c7 h$ }
2、操作人员的疏失
1 D( E* ^( `: \* m+ G 3、已受污染的培养基、血清
3 i* ~, M, S3 O4 a5 i; W. G 4、操作环境不良、实验器具不洁等
( p# x6 G7 o; j* }5 N4 {( |
8 x6 G! i) K l8 x6 l4 N由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
' c: C" m" ~9 N) R8 V$ ]1 V# c- j9 ] `. c F5 G
去除支原体污染： 3 N; j- d6 |( p6 T2 Q
1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
2 @& P, T3 q* B% O$ J0 Z* d, _. q5 _ 2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
& e& z0 u) s3 Y! B 3、Anti-sera I1 I3 |/ |7 v( N: k; \6 h
" [1 {4 J7 c/ J$ C" V% {8 V预防与控制方面可从以下各点加强注意：
; f2 f1 c+ ~, I. q- H
2 C+ Z" {. p" z+ G设备方面： 4 u) d# }; c9 Z* F
1、使用已作支原体测试ok之细胞株
" v7 R1 {: S) ^# ^; m% A 2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞 * K# x7 o1 x; _0 j+ Y6 D
3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞 ) Z8 i0 r: b2 c: C N+ f
/ _* M, [( z8 w) `" H检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。! t( }5 G x/ `- X5 I" p6 e
0 g- ^% L0 ^& o* Z% ~* y7 x实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求) {# |! k: v ~- }' N! _1 i) H+ l
- W4 A. ?2 s/ X- w有关支原体污染之问题与回答：
# g; ^. W3 m4 S/ ?8 b |
3 s# b! h7 B3 P4 }1、应如何避免细胞污染？. {7 h7 S! k3 A$ U, u/ @3 P
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
- V9 p% I& E5 o9 N2 D/ [- D5 C: R$ V( U( g8 n
2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？
6 \; N. B- {8 E. P. P' d6 V 直接灭菌后丢弃之。3 b! @1 K' _9 D) ]* a* H( ?
. N' l9 I, O7 Y5 v$ ~3 I3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
o/ l( m- l, m& Z( n7 }3 t 不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。( i* k, s) }* W* N$ T9 H
1 G9 I# \: y7 m8 ^8 Q( B
4、支原体污染会对细胞培养有何影响？
3 U1 K; P) w1 K# \/ ~2 \ 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
A: j% E% s) _4 B9 I( z l3 k, A1 g6 ]# ?3 p @8 y# c% Q
5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？
; e0 N( v3 K( s' |4 a 直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 W1 N5 K1 r1 o6 I) K% ^
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支原体之检测：
) k' P, q8 ~& V& g+ u* W# p4 H2 Z& b9 F4 P6 S, `) R
直接培养法 - \: z/ X0 X: B) |# B# R
0 x% _" K8 L' q6 Q- G& E* b! H+ I 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。6 b7 H& Y0 Q% m0 v$ b
6 i9 y: B' M5 Q4 Q4 A/ m ?特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
: ?! m9 x- H3 ?6 ^% i0 d+ A' t* R2 g+ q: j
缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
7 L! U' P) |, Y! o* d0 k0 E. [( K4 O
材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。） . e- k9 L1 g9 t/ b% n+ v( z6 e
% X S( [6 b S+ [) C培养基制备：
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基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
" H) ^& b" g- v) p( X" o
) R. |$ ]# E& d A& k; A, u, j2 u+ g· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
# [! }( Y/ G: Q; n" z- v: e4 U, n5 k3 e$ z5 z' s8 T; w! R& _2 k
· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。 ) V& }) i4 I! ]* M
1 `0 V. ]# ?, k& z& k- C2 \1 R· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。
, a4 [5 w+ K! h. h1 t- x6 R! b; _ c9 J9 n7 s
步骤：
4 h( {, y! v) ?, F+ I* s1 V! S! G% n5 y- l% d& ?- X7 P! I4 |* S
· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
& b; d5 S) R9 Q1 L- P& ?3 I+ N
· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
. _9 u$ L, g7 ]: d
/ y5 c2 B" x/ l& i· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
% G2 E3 U' Z! V/ e4 l8 I: i: d, @8 e7 E0 h: ~6 B8 W/ V- H
结果判读：
1 S9 H% V- b$ G% A' m* z
$ [+ t$ ?1 i; m. o* X6 j" i% U9 `· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。! Z) {/ ^) T8 S$ z6 a/ R8 ]* y# e
+ k0 E6 ?1 u2 u+ Q· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。
7 R6 }$ V* p1 a3 N' G$ O I8 t- \+ @! o6 W( N$ a% Z
· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。8 f/ d& \9 x/ G; V4 r2 c
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发表于 2012-1-27 13:39
