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回复 cbjonathan 的帖子5 V; V& t/ p8 A, r) ~/ D/ P. k) @
5 l4 Y. ~: v* J# N5 Y/ R! s& s8 v造成支原体高污染率的原因为：
% f* j! ], \8 ]4 w- K 1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um） 2 o$ m5 k! k/ j- x
2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 $ S6 j) m0 E3 ?2 {+ r& z
3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 ) P6 o; T9 Q1 O7 n6 n5 w- ?
4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染
/ a% O7 A+ ]. @7 T* u' M# W/ e 5、研究或操作人员忽略污染问题/ J8 _2 u! q m
8 Y z+ K2 D/ T* w, I# k支原体污染了来源：2 O) i# v% @9 _% g
1、已受污染的细胞
. }3 f( |/ W( m6 d S 2、操作人员的疏失 0 |1 l# ]% @5 a
3、已受污染的培养基、血清
3 G1 C3 C" ]' {( \& G( v 4、操作环境不良、实验器具不洁等
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由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。: s* Q; U1 O9 d x9 u
5 E$ H. B+ X) n
去除支原体污染：
% O. q" g' T) t& I 1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer） 3 r0 G3 `/ c4 d$ G/ T
2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
1 j6 q) s! n: e 3、Anti-sera
. v% K- L& u) A5 y4 `3 W$ p! ?
9 |$ ?8 f1 a8 M( U7 l1 q# [预防与控制方面可从以下各点加强注意：
/ [9 ^) X* L7 Y
3 G1 w) s Q4 G设备方面： " ?( [/ u5 J+ t B
1、使用已作支原体测试ok之细胞株
: H% P- |! A9 } 2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞 $ {. B& ?; p/ c: V! v! F2 v
3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞
. C4 |7 j* R1 a* t7 y
' p! |# W6 `3 v* L检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
2 H" f' ]& C, p& \1 r6 p1 v2 @# V5 p& v. a0 y
实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
+ `3 @/ q" @: }% s. p: t9 S: D& f. w& N; z( l( _
有关支原体污染之问题与回答：
1 ]3 h6 h9 l5 _+ \* J
7 H, ?: j/ E* p5 E- c1、应如何避免细胞污染？4 C! F' m0 H8 W5 k- E
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 w5 h1 h) R3 ^ v2 y6 Z1 ~
2 l) }. N$ D$ A( k. B
2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？
/ W& F& r# Q! V' h8 v: }* p 直接灭菌后丢弃之。
; b) u+ x6 B- w! V9 c
4 k* h, N7 J7 ^' a8 J* s: u3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？# l6 v: t( ?5 {" X0 S# J, {
不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。
( P' b6 O& ^. H2 s% d- `8 @) P; O1 s; r7 d
4、支原体污染会对细胞培养有何影响？
* d+ y! A) i9 K! a5 _9 v 支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。. K+ q& _6 l: y% W7 G/ ^$ x. R3 W
; h1 A# B9 J( g* j
5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？( m8 j6 Z* i8 T" _5 ?: m
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 ; D4 p' D; W- c0 f6 e$ V/ O
0 Q' ]7 w$ ~+ t$ s7 y; {( J" c1 a
支原体之检测：
. b( P% z7 k$ N f6 u2 j5 T$ A; l( n/ N. s. l+ H
直接培养法
2 @6 O c' L* @$ r( k3 k# y- j
6 C( {! A, }! Q 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
: K" v9 d' ^5 b& q
. [* {$ o5 `9 j& C* M1 H# S0 y特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。+ L7 s# P+ Y4 }/ @9 G+ R0 i: n2 K
) Z: d% N$ N I" b缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
( W' C. Q8 v5 Y8 R, H9 g! U
5 Q& G; ?6 b8 ]9 A- j材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）
* P* s1 K Z* b, U, |+ c+ b
: R( y" q3 {1 R/ G; X培养基制备：
( ?0 a% Q: k+ n: X6 k
3 n! q/ i4 T9 F1 ^ q基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
, t# H: a5 \% X& N+ `% s
' V5 h3 i/ l, _· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。 2 \' k$ U) u5 @# _& [9 ~/ r
6 r: P/ F& ^5 Z" J, G
· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。 5 w# q" w$ O$ z9 |3 ^! D/ C( x
- `. ?1 D1 [$ Y" R· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。
5 e1 G; k+ X; \1 I$ ]! Y G! K7 Z. D3 d2 S8 L* ^) P
步骤：& p; h* E5 s W+ ?7 r
7 }; {& e0 @1 `" y3 I
· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。7 V' v) M2 |* Q2 B! R! }
% |% }7 p+ E2 I* H z i' F
· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。* t8 c8 ~$ S% E0 o# f% N
+ K% L8 [8 y$ [9 k
· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
+ D( u7 O& W3 K
+ t s2 |! {' N结果判读： 1 A; J3 v6 R6 h1 U: {, r& E
$ R; ]# }- g' n( Z2 y· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。6 f8 A" L M* G: n
( u! ?- t+ j8 s8 Y· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。1 x+ b/ e# a- Z! _ D* ]8 n4 T
& E$ p& j9 z6 C) P6 ] @
· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。
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发表于 2012-1-27 13:39
