qRT-PCR结果分析

safflower

5 p# \) W9 {# n0 R. i! {" Q+ v. F最近在做realtime PCR，结果分析显示目的基因表达下调，溶解曲线等参数都挺好的。再将PCR产物拿去跑电泳，条带显示相反结果，非常明显。很纠结，不知该相信哪个？为什么二者不一致？, O2 |0 F4 I! l5 k* Y4 D
5 P7 m, |' W! ]8 D: d! u* q
请高手指点。多谢！

mansnoopy

如果你的realtime没有问题  肯定是相信定量的结果。。。跑胶的结果完全不可信

2006dulifang

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+ O; Y( A. m5 ?& N9 V! b: `& d; t* k" k  k$ n7 f- a# h
看到这个帖子有点晚了。但可以参考我的一点点经验：以质粒为标准时，要看你的样品。如果样品是片段，质粒为标准测的相对比较准。但如果你的样本是病毒，那么测的就会偏低。我最开始用质粒做标准，结果我的样本低于1000左右就测不到了。

huangcong1988

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" k1 h/ T0 H7 N' j
定量基因的拷贝数

张莹莹

回复 huangcong1988 的帖子( r% p! i6 v. S2 N2 y# F
* h; i( L' d* K3 I2 A& s: i
您好，看到你的回复说做的Qrt-pcr用的绝对定量方法，我老师也让我用这种方法，但是具体的还不太清楚，就是如何才能绝对定量呢？

c05241037

模板浓度确定一样么》？一样的条件下CT值不会有差别才对，我之前做的就很稳定

nankou2008

我记得在不同时间做的样品 板间还要设几个孔板间的矫正的 好像是ROX？# O. o" o/ u1 A3 s* j0 \6 C
qPCR结果是精密的 也就决定了在做的时候 任何一个小的地方的误差都能导致最终结果的差异; k- ~/ t! J5 F8 N: f! q6 E
上样时模版量 引物量等等都会有影响 相信这也是qPCR结果难以重复的重要原因9 K. m/ C$ k0 _( r
另外我觉得还是qPCR结果可信点 因为这个过程实时记录扩增过程 看扩增曲线就能看出0 h/ D9 U% b/ u; d
电泳结果只是体外扩增的最后结果 相信产物量达到一定阈值的时候就不太看的出差异了$ h" \2 Q* O; r; ~
况且电泳也只是个粗放的检测方式

2010liao

定量的结果应该可靠些，

huangcong1988

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' d+ k. g* n/ e; X% x; O' x0 h
如果是绝对定量呢？绝对定量不需要内参，咋办？

huangcong1988

回复 frankieisme 的帖子9 z" R: N, v0 J( l

. E1 x/ k( w4 a2 W1 w这个delta Ct值是怎么算的？是拿什么减什么？那个Cp值又是怎么回事？可以直接用吗？