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你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质粒的用量等；下面是我经常用的磷酸钙转染制备慢病毒的方法，包装质粒也是delta 8.91、Pvsvg，从来就没失败过，参考一下, s1 e7 F* e/ R# D1 }) o
磷酸钙转染制备慢病毒) p$ _3 X K1 U, P3 X! P/ R" d
1、 试剂配制8 {6 ]/ ?6 F" }3 t$ ?* H
1.1 2×HBS（500ml体系）:
: _3 I0 L; i$ s) o$ a样品 浓度（mM／L） 质量(g)! }2 l* m, Z/ m- O3 i$ [) ]
NaCl 280mM 8.18g
, y6 I X1 X, j" C O- `KCl 10mM 0.375g* K$ E, h' c+ D4 I" n4 }
Na2HPO4 1.5mM 0.1g
: z9 e* m. `/ z# N, V* tglucose 12mM 1.19g4 f; O5 r' a/ a
HEPES 50mM 5.95g
j+ T0 V/ \$ t' R9 X: X( J+ j 配好pH在6左右，用NaOH调到7.4，加ddH2O 至 500ml 灭菌( ?+ @/ |! T. I/ n5 s. P( u
1.2 2M CaCl2 二水氯化钙 58.8g 加ddH2O 至200ml% i) `+ b* N) v; X+ y% p2 E3 o. D
2、转染步骤$ R! Q- l" ^9 E0 _3 y8 A9 m
（1）、10cm盘293T细胞，50-70%铺满率转染2 C/ T; b: s0 R
（2） 将下列3种组分混匀4 Y4 q2 z6 Q4 }9 e6 r
试剂 体质或质量
+ i; Q9 X. P' q) e灭菌超纯水H2O 600ul2 T" V z5 K0 T8 w; s
Plasmid（质粒）
?, Z; o) s1 Y; m" ?/ y（共270ul） cDNA（目的质粒） 12ug
, C3 ^6 q3 g) C, k- H- S7 g delta 8.91（包装） 9ug
$ Z+ n4 q' U R% a: C Pvsvg（保证） 6ug
1 T; p4 o! ?- [2M CaCl2 132ul" A) J. t' L/ L3 R4 [+ B1 `
（3） 加1000ul的2×HBS ，再吹打50次，充分混匀，立即加入培养皿摇匀，6-8小时换新鲜培养基即可: {; w: d' d+ K. e% O2 N- J
（4） 48小时和96小时分别收集上清即可 |
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发表于 2012-2-28 09:33
发表于 2013-10-9 11:19
