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你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质粒的用量等；下面是我经常用的磷酸钙转染制备慢病毒的方法，包装质粒也是delta 8.91、Pvsvg，从来就没失败过，参考一下% h$ n W& r9 `3 ~1 B6 f! i
磷酸钙转染制备慢病毒
. E; C& L; U! ~9 j4 |1、 试剂配制
! b: f6 E: I' d. G1 ?% _0 ~& Z1.1 2×HBS（500ml体系）:
; H7 ^$ y+ t. s样品 浓度（mM／L） 质量(g)
0 f7 p1 q% q" tNaCl 280mM 8.18g
) ]6 ^' v* i% ]# UKCl 10mM 0.375g
& E0 H. J" \! g+ s5 Z( QNa2HPO4 1.5mM 0.1g
0 H' O2 T5 {5 P3 lglucose 12mM 1.19g
( F$ e9 Q. N4 RHEPES 50mM 5.95g, Y& b" g, Z6 ?9 a
配好pH在6左右，用NaOH调到7.4，加ddH2O 至 500ml 灭菌1 x9 v) ]4 W, m+ x5 p6 U5 U6 t
1.2 2M CaCl2 二水氯化钙 58.8g 加ddH2O 至200ml
7 R! M7 E" F% P0 s$ q7 o* i8 U 2、转染步骤
, R1 K' O( f6 Z( C c7 V7 k （1）、10cm盘293T细胞，50-70%铺满率转染
. t! n. A1 V2 F3 f6 I （2） 将下列3种组分混匀
& c# `' w4 M% {试剂 体质或质量; c# r7 {$ j( T4 p! W
灭菌超纯水H2O 600ul/ V1 T `* i/ _: y
Plasmid（质粒）
) M7 i7 w! o( i9 ^（共270ul） cDNA（目的质粒） 12ug
8 g/ V: X' X0 I& n/ g delta 8.91（包装） 9ug
) y8 ^8 R1 c+ ~8 E6 s2 r1 | p Pvsvg（保证） 6ug
. U. t+ I N1 t# E" t2M CaCl2 132ul$ X, l) `( Y) r5 V2 @5 z& f* u
（3） 加1000ul的2×HBS ，再吹打50次，充分混匀，立即加入培养皿摇匀，6-8小时换新鲜培养基即可* o: p. R3 x3 x9 M
（4） 48小时和96小时分别收集上清即可 |
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发表于 2012-2-28 09:33
发表于 2013-10-9 11:19
