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[请教] 慢病毒包装质粒 能否共用?   [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2012-2-28 09:33 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
向各位请教:慢病毒包装质粒是否能共用?我之前用公司买的慢病毒包装体系里面带的包装质粒包(pCMV-VSVG和8.91)慢病毒,不成功,但是我用了师姐的那三个包装质粒(PL1/2和VSVG)试了下,竟然包出来了。由于不是做分子这方面的不是很懂,想问下这到底取决于什么,只需要HIV病毒的几个部件齐全就可以包慢病毒吗?那到底怎么看呢?谢谢!
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沙发
发表于 2012-2-28 09:57 |只看该作者
  你用什么细胞制备慢病毒,这其中的原因就比较多了;比如你细胞的状态和密度,包装质粒的用量,还有目的质粒的用量等;下面是我经常用的磷酸钙转染制备慢病毒的方法,包装质粒也是delta 8.91、Pvsvg,从来就没失败过,参考一下' i; ~5 K- `/ [6 @1 M7 A# N2 P4 f
磷酸钙转染制备慢病毒) T  {' m) j0 t* ^$ f) q9 ^3 \: z
1、 试剂配制
; `% B' b2 S6 Z2 {. H+ Z/ T) e: x1.1  2×HBS(500ml体系):( P8 u  F, j$ G' C0 G" s0 y: F1 b
样品        浓度(mM/L)        质量(g)
/ O2 A$ I/ q' U% S) q( DNaCl        280mM        8.18g
, s  d3 A9 H9 x& X9 v/ MKCl        10mM        0.375g9 V% }9 t$ x% c; W' C: d. t
Na2HPO4          1.5mM        0.1g. ?' e3 G; k! K' _& G
glucose        12mM        1.19g- S" F# n, r5 x! q7 i
HEPES          50mM        5.95g- w# w/ h4 H" @2 T
        配好pH在6左右,用NaOH调到7.4,加ddH2O 至 500ml 灭菌& i* Q& }6 F: S6 h5 x8 C1 c& h
        1.2  2M CaCl2    二水氯化钙 58.8g  加ddH2O 至200ml
; O/ u, @0 `6 A4 ?  `: `" n$ F        2、转染步骤
7 z$ e8 U4 E# m) p, K& Q! x        (1)、10cm盘293T细胞,50-70%铺满率转染- H; Y4 @( ]9 H: K! n
(2)  将下列3种组分混匀/ N+ Q- H. X  v3 H1 j% h, h; _3 R
试剂        体质或质量
) W3 H; M8 Z5 r/ g灭菌超纯水H2O        600ul+ s$ w7 s1 A7 E1 G! K# d* r+ x, e7 O6 ^
Plasmid(质粒)8 c: e: K( A( Y3 A  T7 v8 g( ]# z
(共270ul)        cDNA(目的质粒)          12ug% B/ S% e, z6 l/ K- R; ?
        delta 8.91(包装)        9ug1 z8 l9 C9 Y7 r
        Pvsvg(保证)        6ug2 @" U5 ^  W/ S7 W
2M CaCl2        132ul
- m7 R3 q. |- w8 K        (3) 加1000ul的2×HBS ,再吹打50次,充分混匀,立即加入培养皿摇匀,6-8小时换新鲜培养基即可
+ [# e) Y. ~$ |* D" s(4) 48小时和96小时分别收集上清即可
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藤椅
发表于 2012-2-28 10:17 |只看该作者
长知识啊

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发表于 2012-2-29 09:09 |只看该作者
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同问,可否共用?

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报纸
发表于 2012-2-29 10:42 |只看该作者
xiongjiedeng,您好,太谢谢你了,你也用过delta 8.91和pvsvg包过慢病毒。我对这两个质粒分别酶切跑胶鉴定过,没有问题,但是用感受态做大抽时经常提不出来,不知道何缘故,所以我怀疑了质粒的问题。我也用磷酸钙转染制备慢病毒,293T细胞,我相信包病毒过程没有问题,因为我的对照证明包装成功的。请问你有这两个包装质粒的详细图谱吗?校对下。还有,你地点在哪?可以问你要点包装质粒或者菌吗?谢谢!
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发表于 2012-3-1 15:19 |只看该作者
回复 刘森泉 的帖子# B% i1 n8 q) M" g% [- e

" |4 B% _  M! T# h7 @/ d0 d9 f' t0 w* K我们实验室用量比较大,包装质粒都是自己大提出来的,我在长沙,你呢?
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发表于 2012-3-1 17:23 |只看该作者
谢谢!我在杭州,方便给我一点吗?

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发表于 2013-10-8 09:45 |只看该作者
xiongjiedeng 发表于 2012-2-28 09:57
5 _* C9 I+ C' B你用什么细胞制备慢病毒,这其中的原因就比较多了;比如你细胞的状态和密度,包装质粒的用量,还有目的质 ...

) U. M5 G0 N1 C8 N想请教一下。请问D8.91和VSVG用以包装质粒时。对表达质粒有要求吗?我用的是pCDH-CMV-EF1-copGFP,请问也可以用这个包装系统包出病毒么?期待您的回复。谢谢
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发表于 2013-10-9 11:19 |只看该作者
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发表于 2013-12-6 17:54 |只看该作者
小弟现在做p53对转化细胞代谢的影响,急求TET四环素诱导的wt-p53质粒,对接下来的实验非常重要,跪求论坛里的园友谁有这个质粒,可否赠小弟一点,不胜感激!
& t# C% h. k% G* R0 y! ^* o/ S  X人的或者大鼠的野生型p53都可以。
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