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[请教] 慢病毒包装质粒 能否共用?   [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2012-2-28 09:33 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
向各位请教:慢病毒包装质粒是否能共用?我之前用公司买的慢病毒包装体系里面带的包装质粒包(pCMV-VSVG和8.91)慢病毒,不成功,但是我用了师姐的那三个包装质粒(PL1/2和VSVG)试了下,竟然包出来了。由于不是做分子这方面的不是很懂,想问下这到底取决于什么,只需要HIV病毒的几个部件齐全就可以包慢病毒吗?那到底怎么看呢?谢谢!
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沙发
发表于 2012-2-28 09:57 |只看该作者
  你用什么细胞制备慢病毒,这其中的原因就比较多了;比如你细胞的状态和密度,包装质粒的用量,还有目的质粒的用量等;下面是我经常用的磷酸钙转染制备慢病毒的方法,包装质粒也是delta 8.91、Pvsvg,从来就没失败过,参考一下% h$ n  W& r9 `3 ~1 B6 f! i
磷酸钙转染制备慢病毒
. E; C& L; U! ~9 j4 |
1、 试剂配制
! b: f6 E: I' d. G1 ?% _0 ~& Z1.1  2×HBS(500ml体系):
; H7 ^$ y+ t. s样品        浓度(mM/L)        质量(g)
0 f7 p1 q% q" tNaCl        280mM        8.18g
) ]6 ^' v* i% ]# UKCl        10mM        0.375g
& E0 H. J" \! g+ s5 Z( QNa2HPO4          1.5mM        0.1g
0 H' O2 T5 {5 P3 lglucose        12mM        1.19g
( F$ e9 Q. N4 RHEPES          50mM        5.95g, Y& b" g, Z6 ?9 a
        配好pH在6左右,用NaOH调到7.4,加ddH2O 至 500ml 灭菌1 x9 v) ]4 W, m+ x5 p6 U5 U6 t
        1.2  2M CaCl2    二水氯化钙 58.8g  加ddH2O 至200ml
7 R! M7 E" F% P0 s$ q7 o* i8 U        2、转染步骤
, R1 K' O( f6 Z( C  c7 V7 k        (1)、10cm盘293T细胞,50-70%铺满率转染
. t! n. A1 V2 F3 f6 I (2)  将下列3种组分混匀
& c# `' w4 M% {试剂        体质或质量; c# r7 {$ j( T4 p! W
灭菌超纯水H2O        600ul/ V1 T  `* i/ _: y
Plasmid(质粒)
) M7 i7 w! o( i9 ^(共270ul)        cDNA(目的质粒)          12ug
8 g/ V: X' X0 I& n/ g        delta 8.91(包装)        9ug
) y8 ^8 R1 c+ ~8 E6 s2 r1 |  p        Pvsvg(保证)        6ug
. U. t+ I  N1 t# E" t2M CaCl2        132ul$ X, l) `( Y) r5 V2 @5 z& f* u
        (3) 加1000ul的2×HBS ,再吹打50次,充分混匀,立即加入培养皿摇匀,6-8小时换新鲜培养基即可* o: p. R3 x3 x9 M
(4) 48小时和96小时分别收集上清即可
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藤椅
发表于 2012-2-28 10:17 |只看该作者
长知识啊

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板凳
发表于 2012-2-29 09:09 |只看该作者
干细胞之家微信公众号
同问,可否共用?

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报纸
发表于 2012-2-29 10:42 |只看该作者
xiongjiedeng,您好,太谢谢你了,你也用过delta 8.91和pvsvg包过慢病毒。我对这两个质粒分别酶切跑胶鉴定过,没有问题,但是用感受态做大抽时经常提不出来,不知道何缘故,所以我怀疑了质粒的问题。我也用磷酸钙转染制备慢病毒,293T细胞,我相信包病毒过程没有问题,因为我的对照证明包装成功的。请问你有这两个包装质粒的详细图谱吗?校对下。还有,你地点在哪?可以问你要点包装质粒或者菌吗?谢谢!
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地板
发表于 2012-3-1 15:19 |只看该作者
回复 刘森泉 的帖子
+ Z' ^8 z" Q+ {2 c( g8 j# K' m2 ^3 y
( X( s; y( j- w- E" [/ x- g* X7 h我们实验室用量比较大,包装质粒都是自己大提出来的,我在长沙,你呢?
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发表于 2012-3-1 17:23 |只看该作者
谢谢!我在杭州,方便给我一点吗?

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发表于 2013-10-8 09:45 |只看该作者
xiongjiedeng 发表于 2012-2-28 09:57 , t% j# \5 d7 J! C- l$ g5 G4 Y
你用什么细胞制备慢病毒,这其中的原因就比较多了;比如你细胞的状态和密度,包装质粒的用量,还有目的质 ...

5 `/ P9 |8 a1 e: p$ M4 B9 h想请教一下。请问D8.91和VSVG用以包装质粒时。对表达质粒有要求吗?我用的是pCDH-CMV-EF1-copGFP,请问也可以用这个包装系统包出病毒么?期待您的回复。谢谢
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小小研究员

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发表于 2013-10-9 11:19 |只看该作者
回复 Sushi_Tuang 的帖子8 j. {0 f  {) r6 [
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发表于 2013-12-6 17:54 |只看该作者
小弟现在做p53对转化细胞代谢的影响,急求TET四环素诱导的wt-p53质粒,对接下来的实验非常重要,跪求论坛里的园友谁有这个质粒,可否赠小弟一点,不胜感激!
. |8 J) P& i( V. K6 h" D人的或者大鼠的野生型p53都可以。
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