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你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质粒的用量等；下面是我经常用的磷酸钙转染制备慢病毒的方法，包装质粒也是delta 8.91、Pvsvg，从来就没失败过，参考一下
* n) F l3 Y1 K磷酸钙转染制备慢病毒$ Q5 \3 ]% P( O8 o+ l4 D
1、 试剂配制0 j% L& y& Y& m- f+ q q5 z
1.1 2×HBS（500ml体系）:) G1 t* T! D, Q$ t5 P$ f
样品 浓度（mM／L） 质量(g)
6 T" y [7 B yNaCl 280mM 8.18g
) E+ u( O1 x$ b, L( QKCl 10mM 0.375g, R# o7 S: U) k
Na2HPO4 1.5mM 0.1g
. |7 y- k; }' l. ?glucose 12mM 1.19g: G( M1 h! S8 c. J
HEPES 50mM 5.95g' j4 @$ g/ j$ h5 S
配好pH在6左右，用NaOH调到7.4，加ddH2O 至 500ml 灭菌* Z* [- b- x& ~# X
1.2 2M CaCl2 二水氯化钙 58.8g 加ddH2O 至200ml
' Z5 w0 j1 ?9 z \9 k2 V% {1 w, R* w 2、转染步骤: l. {" W4 K& a6 c+ R
（1）、10cm盘293T细胞，50-70%铺满率转染
! R$ S6 S+ Y' Y （2） 将下列3种组分混匀
+ V3 u7 z! }2 }) ]: D& z# f5 D试剂 体质或质量" n0 s; ~$ r% \, @ b
灭菌超纯水H2O 600ul
0 O' p6 u4 h7 ?: S" M# _Plasmid（质粒）3 ~7 N3 J' C, s! C" }
（共270ul） cDNA（目的质粒） 12ug, q- Y# D1 I5 _. S2 |, H, v6 \
delta 8.91（包装） 9ug6 Q! y! ~0 g9 l
Pvsvg（保证） 6ug
8 k8 L0 b+ E" ^) Q3 r* f; A2M CaCl2 132ul$ W$ _( s$ Z( Z2 p. Q
（3） 加1000ul的2×HBS ，再吹打50次，充分混匀，立即加入培养皿摇匀，6-8小时换新鲜培养基即可. i/ r! ?1 i: F3 u! a2 w8 n! Q
（4） 48小时和96小时分别收集上清即可 |
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发表于 2012-2-28 09:33
发表于 2013-10-9 11:19
