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你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质粒的用量等；下面是我经常用的磷酸钙转染制备慢病毒的方法，包装质粒也是delta 8.91、Pvsvg，从来就没失败过，参考一下' i; ~5 K- `/ [6 @1 M7 A# N2 P4 f
磷酸钙转染制备慢病毒) T {' m) j0 t* ^$ f) q9 ^3 \: z
1、 试剂配制
; `% B' b2 S6 Z2 {. H+ Z/ T) e: x1.1 2×HBS（500ml体系）:( P8 u F, j$ G' C0 G" s0 y: F1 b
样品 浓度（mM／L） 质量(g)
/ O2 A$ I/ q' U% S) q( DNaCl 280mM 8.18g
, s d3 A9 H9 x& X9 v/ MKCl 10mM 0.375g9 V% }9 t$ x% c; W' C: d. t
Na2HPO4 1.5mM 0.1g. ?' e3 G; k! K' _& G
glucose 12mM 1.19g- S" F# n, r5 x! q7 i
HEPES 50mM 5.95g- w# w/ h4 H" @2 T
配好pH在6左右，用NaOH调到7.4，加ddH2O 至 500ml 灭菌& i* Q& }6 F: S6 h5 x8 C1 c& h
1.2 2M CaCl2 二水氯化钙 58.8g 加ddH2O 至200ml
; O/ u, @0 `6 A4 ? `: `" n$ F 2、转染步骤
7 z$ e8 U4 E# m) p, K& Q! x （1）、10cm盘293T细胞，50-70%铺满率转染- H; Y4 @( ]9 H: K! n
（2） 将下列3种组分混匀/ N+ Q- H. X v3 H1 j% h, h; _3 R
试剂 体质或质量
) W3 H; M8 Z5 r/ g灭菌超纯水H2O 600ul+ s$ w7 s1 A7 E1 G! K# d* r+ x, e7 O6 ^
Plasmid（质粒）8 c: e: K( A( Y3 A T7 v8 g( ]# z
（共270ul） cDNA（目的质粒） 12ug% B/ S% e, z6 l/ K- R; ?
delta 8.91（包装） 9ug1 z8 l9 C9 Y7 r
Pvsvg（保证） 6ug2 @" U5 ^ W/ S7 W
2M CaCl2 132ul
- m7 R3 q. |- w8 K （3） 加1000ul的2×HBS ，再吹打50次，充分混匀，立即加入培养皿摇匀，6-8小时换新鲜培养基即可
+ [# e) Y. ~$ |* D" s（4） 48小时和96小时分别收集上清即可 |
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发表于 2012-2-28 09:33
发表于 2013-10-9 11:19
