请教干细胞成骨成脂染色及染色方法

wuyannini

& w5 x/ h: t, i' W$ N( C& X% z
6 b% X$ p8 S# Z, u8 B  {0 d$ v我在做干细胞的成骨、成脂分化鉴定。查了网上关于成骨成脂的染色及染色液的配制，但有出入。谁做过这样的实验，并且比较成功，能否提供染色液的配制方法及染色方法？谢谢啦
, r& j" `/ p4 F5 E! ~" {5 D4 Y5 Q3 N" p1 x% h* C
另外补充：请不要从网上粘贴过来，需要的是已经做过并成功的方法。拜托啦！

zerollx

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, B: C! d' w% p$ \( t
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8 ^% Q/ t& C/ `' A7 e. N9 O  `成脂：
5 ~* i  F5 Q( ~9 ~ 油红-O染料：' l" v  P. M: g: N/ b, ]$ U
       储液：0.7g油红-O溶解在200ml的异丙醇中，0.2um滤器过滤（除去沉淀），室温储存。
( G7 g1 j/ g1 V% a3 u! l2 D      工作液：配成上述浓度60%的浓度，即加30ml储液，20ml蒸馏水，混匀，室温放置30min，若有眼见的沉淀物，可再次过滤，24h内使用。! `4 J! k$ f# L& f; Q4 p+ u$ z. Y
染色：
5 {2 X" F% K' \' j) C1 q, j8 l 固定：弃去培养基，DPBS洗涤2遍，4%多聚甲醛固定10min，弃去固定液，DPBS洗涤3遍（此步后可在4度保存半个月）0 L2 O7 J" C' _& ]1 U* J" \
         六孔板中每孔加2ml油红-O染料，室温孵育20~60min。2 Z2 W* ]* k. L3 C" \( s* u
脱色：用2ml DPBS洗涤直至背景色干净，注意一定要洗干净（不要加太多的DPBS洗涤，否则会将染料浮起得更高将皿壁也染上），有效的洗完之后，加入2ml的DPBS,倒置显微镜下观察。3 }5 V3 ?; f# o8 Y8 W& G

zerollx

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% x+ s8 K; j3 N/ |! I% u1 x3 {4 W) ?+ z# V
成骨：
) ~+ v3 A9 h: w8 r2 K! K& B（1）染液配制：
3 m- x0 d3 J2 J! R: Y* x7 O 1g的茜素红S溶解于100ml的蒸馏水中，用0.1M的NaOH调节pH至4.1–4.3 ,0.2mM滤膜过滤，室温避光保存
) ?6 d  Z3 u1 P2 H  P5 {- d（2）染色
) @7 B* t  ^/ L  q$ m3 i1、弃去培养基，用DPBS洗涤3遍2 k1 h: n' t4 i* `" m0 C# U% G
2. 4%多聚甲醛室温至少固定15min。
4 b% ?  z5 `- D, R" v: @2 w3. 1%茜素红染液固定10min。* i# W9 C. _+ O& V" g" n# v0 S
4. DPBS洗涤细胞，以尽量去除残余的染液。" n4 h+ r$ H; T3 S
5、加入DPBS，拍照。
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573639471

学习了

wuyannini

非常感谢

wuyannini

回复 zerollx 的帖子7 s$ ]) E' Y) B

( w$ q$ W# y2 ~' F& N) S0 ^" S茜素红的配置怎么是1%的啊？我查了好多都是0.1%的，到底哪个浓度的准确啊？

zerollx

回复 wuyannini 的帖子1 C, K9 i. b4 j8 n/ V

" m$ {' G( S4 }: w$ D" L我用的是1%的，我曾经尝试过0.1%，在同样的时间内是染不出来的，也许延长染色时间可以，但我没有尝试过！

wuyannini

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$ X# X% O7 ]) t  J! G
5 r; @7 P+ T6 v( S/ f7 |我先用1%的茜素红试了一下，孵育完毕后，染液好多去除不掉，影响照相，最后还是选择用的0.1%的。谢谢啦

沙漠狐o0

请教下,为什么我做的成骨分化实验,细胞在16天左右密度过大不贴壁了,会漂浮在培养基中...?