请教干细胞成骨成脂染色及染色方法

wuyannini

- A& W  C! E6 N4 v
" o; H; ~; ]3 W7 \1 H我在做干细胞的成骨、成脂分化鉴定。查了网上关于成骨成脂的染色及染色液的配制，但有出入。谁做过这样的实验，并且比较成功，能否提供染色液的配制方法及染色方法？谢谢啦' x0 P" n$ l* C' A& S
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另外补充：请不要从网上粘贴过来，需要的是已经做过并成功的方法。拜托啦！

zerollx

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: A$ V2 o2 D( Z回复 wuyannini 的帖子
- B5 x' Y- k6 F& M, k( `; [
0 t* Y0 A8 F6 H# a/ M& q4 g成脂：
" p6 k" B4 O7 n: M- u 油红-O染料：
$ K8 z) E" x3 j# V- C8 s, J2 z, D9 k6 K       储液：0.7g油红-O溶解在200ml的异丙醇中，0.2um滤器过滤（除去沉淀），室温储存。; }( X* d+ x/ U7 P& m0 ~+ x
      工作液：配成上述浓度60%的浓度，即加30ml储液，20ml蒸馏水，混匀，室温放置30min，若有眼见的沉淀物，可再次过滤，24h内使用。; O: ^  q$ W2 S( o+ y$ X
染色：
' w. m) o% t6 g) L5 F 固定：弃去培养基，DPBS洗涤2遍，4%多聚甲醛固定10min，弃去固定液，DPBS洗涤3遍（此步后可在4度保存半个月）) a+ Q9 W5 r; }- ]# v& f  L
         六孔板中每孔加2ml油红-O染料，室温孵育20~60min。
) e' F9 i% Q3 J. h, C5 j0 ~% A 脱色：用2ml DPBS洗涤直至背景色干净，注意一定要洗干净（不要加太多的DPBS洗涤，否则会将染料浮起得更高将皿壁也染上），有效的洗完之后，加入2ml的DPBS,倒置显微镜下观察。  W" q) ?! t5 `' [" B1 }3 X

zerollx

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( P& [2 O0 c  B6 q: z. |. w
: b% e  @3 x" H( G2 E- |; B8 A1 s7 i成骨：1 B/ n- ^6 B2 G' j4 o) g
（1）染液配制：* M# q  D9 k9 Z- W' D
1g的茜素红S溶解于100ml的蒸馏水中，用0.1M的NaOH调节pH至4.1–4.3 ,0.2mM滤膜过滤，室温避光保存
! u7 v. n5 u; H: U+ Z# W7 {* K（2）染色
8 X) N$ x. W" m# I  f2 b/ x1、弃去培养基，用DPBS洗涤3遍
6 P$ Q; h7 D6 A' ^2. 4%多聚甲醛室温至少固定15min。# F( r  g4 I( I8 y5 i- _: a
3. 1%茜素红染液固定10min。% \" d; A8 s( w) P; ]' Y" S
4. DPBS洗涤细胞，以尽量去除残余的染液。8 D# m- f9 |! C# ^7 W
5、加入DPBS，拍照。
8 H" [; C9 }8 a0 Z# U" H$ L2 b' j

573639471

学习了

wuyannini

非常感谢

wuyannini

回复 zerollx 的帖子! H, ^, a) L! P' ~- V8 [/ ^

5 Q1 `0 _" |6 B" c6 W# r3 u茜素红的配置怎么是1%的啊？我查了好多都是0.1%的，到底哪个浓度的准确啊？

zerollx

回复 wuyannini 的帖子0 m% w9 l! [! j' y

# F3 ^3 w8 F2 {4 S" j) j4 f; d我用的是1%的，我曾经尝试过0.1%，在同样的时间内是染不出来的，也许延长染色时间可以，但我没有尝试过！

wuyannini

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: u/ {! d& ^  p7 M) x% R
0 C: c6 l1 b  O0 t: d我先用1%的茜素红试了一下，孵育完毕后，染液好多去除不掉，影响照相，最后还是选择用的0.1%的。谢谢啦

沙漠狐o0

请教下,为什么我做的成骨分化实验,细胞在16天左右密度过大不贴壁了,会漂浮在培养基中...?