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最近摸索了一段时间,还没成功,有一些经验,但也有迷惑,蹦出来分享并求解:3 N; G d- r9 \+ O2 X0 U, ]) C
首先,洗净脐带,用剪开浆膜(最好从两根动脉之间),依次剔除两根动脉,静脉就不剔了,因为静脉壁很薄,跟周围胶体连接很紧。再用有齿镊提起胶体,顺脐带轴方向剪下细长条状,再将其剪成小块,最好1~3mm3; u9 u M# Z3 R- c3 U5 Q3 H
然后,消化前将组织块PBS洗两遍,0.1%胶原酶2消化4h,接着加0.25%胰酶消化30min。因为消化液很黏稠,加PBS稀释,过滤。3 U5 u0 ^6 A. y) ~
离心我是用的1500,10min,但是昨天做的感觉离心力不够,离心下来细胞不是很多。1 `4 N K/ K8 [6 Z, l
求解:1. 消化液稀释后仍然很黏,是不是要加大转速或延长离心时间?以前试过3000,10min,但是有很多杂质。求合适的转速及时间!% P2 o5 y$ j: q0 X1 d( k
2. 过滤的时候会不会胶原蛋白堵塞网孔,导致细胞滤不下去啊?有办法解决吗?5 }# ~) }2 ?5 R$ O* U
3. 个人感觉胶原酶消化4h,还是有点短,请问当组织块消化到什么状态说明消化的差不多了。 |
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