酶消化法分离培养脐带间充质干细胞

细胞干

最近摸索了一段时间，还没成功，有一些经验，但也有迷惑，蹦出来分享并求解：. n( a+ ^$ x5 `9 H
首先，洗净脐带，用剪开浆膜（最好从两根动脉之间），依次剔除两根动脉，静脉就不剔了，因为静脉壁很薄，跟周围胶体连接很紧。再用有齿镊提起胶体，顺脐带轴方向剪下细长条状，再将其剪成小块，最好1~3mm3/ `  b- R  c$ c
然后，消化前将组织块PBS洗两遍，0.1%胶原酶2消化4h，接着加0.25%胰酶消化30min。因为消化液很黏稠，加PBS稀释，过滤。1 ^3 _" D- t3 z' T$ L
离心我是用的1500，10min，但是昨天做的感觉离心力不够，离心下来细胞不是很多。
8 ?) Y# d2 X" d6 v- M8 c求解：1. 消化液稀释后仍然很黏，是不是要加大转速或延长离心时间？以前试过3000,10min，但是有很多杂质。求合适的转速及时间！
/ H0 e. a9 X! k5 u6 O9 H, x* k* G" F          2. 过滤的时候会不会胶原蛋白堵塞网孔，导致细胞滤不下去啊？有办法解决吗？
4 D3 k9 u/ h/ a( V9 F! r          3. 个人感觉胶原酶消化4h，还是有点短，请问当组织块消化到什么状态说明消化的差不多了。

andylee824

第一，要尽可能剪碎，1平方毫米吧；第二，10倍稀释后离心。第三，离心，我都是用 3000,10min，反正后面还用筛网；第四，胶原酶消化要至少8小时吧。

上帝帮我转运吧

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7 c9 y+ F$ P5 N, L
- h- ~1 [, Q9 q  E4 u1、胶原酶消化时我稀释了四倍，感觉还可以。
  |8 e# d5 A2 C$ Z0 _8 p2、静脉不难剔除，一、可以先从静脉管周围的胶剥下来，然后静脉管壁就会显露出来，就可以直接拿掉，这样很好弄；二、你也可以从静脉管中间先撕开，然后把那层薄薄的壁拿掉也可以。为了纯度，还是尽量把静脉管拿掉吧。

yangwy028

楼主这样的方法貌似根本就不能够养出来细胞的。敢问楼主是否曾经养出来过间充质细胞？形态一切都正常吗？静脉其实不难剥离啊。但是如果不剔的话影响很大的，养出来的细胞太杂。楼主您说话这么肯定，是实验成功了吗？

细胞海洋

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细胞干

不会出现静脉细胞，只要剪下胶体，静脉留下来，3cm一段，胶体够用了

xiaolong

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- B3 O) M3 `+ @* _. b( {; P, L, \( D3 Q
借问一下楼主，如果静脉不剔除，在培养间充质细胞是，不可避免的会有静脉细胞大量的出现，你怎么纯化间充质细胞？2 E/ o: q) V: {4 l# b- n3 s# f( F
另附：只要你消化的时间合适，胶原蛋白是不会影响细胞过滤不过去的，胶原蛋白比细胞小的多

小豆

楼主的转速、时间好像有点偏差，我赞同二楼的，你是否试试换个酶？

jiangfengde

我第一次做的时候消化液也很粘稠，根本滤不过去，建议将消化液分装，用大量PBS也清洗，大概10到20倍体积，只要稀释的够，过200目没问题。关于离心转速和时间，可以采用密度梯度离心，先2500r/min,15分钟，取上清稀释后再1500r/min,10分钟，最后再800r/min,5分钟，据说效果不错，不妨一试。消化时间不好掌握，要根据组织块多少来定，摸索中......