请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

xuyang0317

消化后可以加血清终止反应的，不需要稀释！

jxaf3900824

消化过后一定要大量稀释、清洗，酶对细胞损伤很大

细胞干

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0 `$ ~4 i# K- B& [1 s7 B6 M3 P% Y3 q; E4 w) F9 T* s
请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？" j  v$ t8 _; F% A0 m/ t
2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？

上官冰梦

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9 T5 F! x  T' d% `' e0 \
为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

yingjie

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9 g, u' B: l2 H! |- f
: C9 S+ W7 b" z4 K7 H# L 大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法8 Y5 b0 H- n5 l
; b; W& [1 b( T: j- Y% T9 j
Wharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的
4 Y) j$ P4 O, r; x6 ^! ?小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h
7 r  E+ R4 X: ~8 o8 e, \% R" {/ D    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是' E: @7 X/ m8 Z4 S1 U: {6 [& _3 D' b
胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。5 ]0 n% ]8 C2 j3 g! v
    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理305 B8 G4 C6 U5 J8 i$ f( l- y
分钟，轻轻摇动。' @5 R% O2 D. P7 A
    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。
5 `4 ~' Q5 X) K' I    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.9 O% U6 O. |3 g+ c1 C: I
    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少
3 H4 T! s7 z0 G( ]3 c" b' r许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在& m$ O5 b, {8 t8 _0 m* y# g& O
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.2 O/ ~( E  F$ q
; Y) X6 V( f2 E4 R# {
     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉  e  m2 g" z1 G" Z# h

细胞干

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, M+ F* q5 g2 B/ y7 b' C
# C) Z! \  _9 n! m6 P! x7 E是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

细胞干

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& S0 Q% g# H, c& f! S
" _# ^. }% D* ]( S0 d9 ~' M! x我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。
, M3 j% f) C8 k" ~; w我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。( Z5 x* g0 x  l2 F% \
消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。' u- C4 S( M' z* K
但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。
. q" r+ y+ o6 J) W* w: M2 X3 d请问你是怎么做的，结果怎么样？
. |( Z; u& D: U# n7 @' ]/ h: ^

赵贵芳

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1 b9 N9 U7 l5 ~请问是哪三种酶啊？

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的