请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

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8 u0 t( p8 {0 {" C
  o: a, ~! q" M( P+ I) _+ A请问是哪三种酶啊？

细胞干

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6 q& M9 S. v4 g  L3 ~5 a+ C: X( L+ t+ @
我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。+ x: q& {' L" h# g; Y( ]$ T
我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。
, z' Q5 u; v( a消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。
# j% k/ O: o5 }  G4 Z  b但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。
3 r' y/ @' L, p4 k  J请问你是怎么做的，结果怎么样？) h; g7 m. F0 k

细胞干

回复 pailishi 的帖子% ~9 I' s- z- ^$ x( f( Y
/ T1 K; K; L9 |5 r
是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

回复 细胞干 的帖子+ F- n7 d1 ^  P/ q& w0 u/ j" U

+ V& P" D3 L; x! ^ 大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法
1 ]8 v1 r& f6 |, G2 ~1 w- O1 @  W, u+ f  E+ Z, B2 o! W  v
Wharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的# G, U; r2 S! q8 a
小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h2 |4 f; V: h: G& W4 c8 @; j; E2 d
    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是
4 ]6 S9 w" l! Y8 c& t) d6 _胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。
. Z1 r% j! ?) M! ]    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30  |# d/ x7 T7 q) [5 P- \; S
分钟，轻轻摇动。! S8 |; J7 B8 O6 q
    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。
( n- s3 c: T' a# V/ ]- W. j# D    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.
5 V6 u" C5 h7 x) R. N$ f8 }    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少" N! U* R& X8 g" o
许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在* N: w8 T( V1 C7 r- d; e
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.9 Y- g# u% {% B6 f0 a  M
5 [1 O+ b. M8 a% v6 d- }
     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉( F) }$ g6 S+ N

上官冰梦

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2 |1 M& r- S* z% s. b为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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  m; [4 j9 C1 a6 T
请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？
5 o3 A& ]6 m  Q6 Y2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？