请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

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& p6 p! R+ \5 [4 m6 p4 S/ \0 O$ [& a% E) \4 R
请问是哪三种酶啊？

细胞干

回复 yingjie 的帖子, i+ r4 O# g1 Q

, n1 ]( A6 M7 S* p我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。
* O# _4 \. f/ e& [! ?6 r6 e1 n8 L4 r我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。
' ]+ B4 j2 O7 N1 X$ j消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。' y% Q9 q7 ~8 _! _: i& ]
但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。
/ R  w3 l: q) P2 H6 t请问你是怎么做的，结果怎么样？5 w+ o, M' \% P

细胞干

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7 M9 @2 z, [$ M' Z2 M5 z+ u
, B9 X# Y+ m' v' Q5 q是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

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! ^" n, F+ f. m0 p9 U0 d+ j: d, M$ e# L2 B. u& J
大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法+ I; [# L7 t. s( Y1 k

+ ^1 _3 B  D4 PWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的
( a' _$ o" c6 J; C3 h/ g6 v: h" P小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h/ s0 j# ?4 v: O  X. z8 b* ^
    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是
; g6 |$ x$ G0 |) A, s胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。
2 n; I" h: F: V9 \( ~    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30# ?; k2 t2 v! Q" x2 w% Z3 [
分钟，轻轻摇动。
! r! ^+ U% u# U' `4 O8 E5 F    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。4 ^- ?2 g- S  ~* c! S! ~% @
    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.
, t) b) X* O1 c' R6 u, g4 v3 z    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少
: a# e3 a- t2 U. b. f许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在) F& m6 l& O7 y+ y, [& d
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.' J# g2 t% B1 W4 C8 R. Q

1 p3 \! I6 d% o6 Q8 p7 h' w     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉
+ Z$ y1 s+ t+ v2 h2 t6 h$ o

上官冰梦

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) `9 \7 c7 F( C' C2 r
( `$ E% ]4 Z2 ^, J% A# K9 p) n为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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/ ?) v+ q1 e7 v) g: [! }8 w! Y请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？
4 s+ K$ }& n4 O0 H2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？