请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

xuyang0317

消化后可以加血清终止反应的，不需要稀释！

jxaf3900824

消化过后一定要大量稀释、清洗，酶对细胞损伤很大

细胞干

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( C& ~% ]2 S( A+ T# m. d: v
: o* i9 c7 }. Q& Q0 K请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？
! D. e- Y* y7 [6 U4 k2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？

上官冰梦

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( g6 @  L2 Z' B" b: N. A- q0 o0 e. f) i
为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

yingjie

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6 L+ @: d, O" g3 s, O  r% `/ }* j6 m- x# m" u2 I5 z
大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法
2 G4 h- U5 ]0 i% {. Q  o' ?* t4 I0 V- K4 F2 `+ Z8 h! N( f6 K
Wharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的1 K0 ^7 D5 H/ [& e/ f" J
小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h
2 \2 l5 G8 @* S4 R! u; a    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是
9 x' n; u3 z* W/ r& B7 I' e胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。
# Z# e! p$ V3 C: C# z" k+ m. |; K3 c    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30# B* e. C7 O' w1 Q2 O
分钟，轻轻摇动。% f6 ^! g! q1 \% _1 p, G# z
    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。0 Z1 l* R- z/ y$ v8 U$ ?% \
    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.: Y9 E" A" _7 `9 X
    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少
! _; w- q* X9 E9 l$ Q( a6 q许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在
# g1 Q4 t+ I3 j0 Y, ^1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.
6 g- W1 i( P, V) ^+ L" V
, D1 }2 J0 G$ I7 y     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉/ E9 k0 G% b! {; i; u; W" O

细胞干

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. {+ i& J3 N. Q* L% ?' [+ U" Y! ^# D# V" v* Y/ I1 W+ t, B
是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

细胞干

回复 yingjie 的帖子! P0 F8 Z- P2 w2 D

- z6 ^( m" S# q6 F9 N1 {1 {我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。
: w+ {3 O# ~) {+ Y8 f  c. t我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。! X% H3 a! ~+ \; u+ s
消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。/ D3 I" l$ h( x% A
但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。
7 o# ~% l2 B0 B% U请问你是怎么做的，结果怎么样？* K# \* R, T5 U0 A/ n4 ]8 l! B/ c

赵贵芳

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& K5 k' r5 R) `
) m6 c2 I1 \; t请问是哪三种酶啊？

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的