请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

xuyang0317

消化后可以加血清终止反应的，不需要稀释！

jxaf3900824

消化过后一定要大量稀释、清洗，酶对细胞损伤很大

细胞干

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4 \1 y1 S: {$ I" k8 Q1 P9 g1 Z
请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？0 \4 X' J! B5 L  L0 A$ V
2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？

上官冰梦

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( O' L. E* v" c. j; @( B5 D0 {) U0 U( @% }# Q3 o0 b
为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

yingjie

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$ ^9 g$ N9 a8 w( m
" Q( ?4 z7 ]! t 大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法! i1 i* m+ d: N* l9 }5 m7 L1 l
8 ^& S4 y9 g) L8 L( m1 E. u
Wharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的
% E) v; q: l9 d- D7 c- ^" s小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h
- Z5 u# v" ?; Y, b( u    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是
; a6 A$ e8 ?% g+ B9 b; d胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。  j6 Q# Z7 l$ Z6 p+ ]0 X7 Q( [
    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30
2 C& B' o/ k$ W/ U; m1 m4 ^分钟，轻轻摇动。
5 q" }- e- g# }1 R* v    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。
- k- A: }  Q( j7 w6 j    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.+ Y4 l. V9 {1 P! p+ y* Q
    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少9 ~  ?1 [- x+ T+ X) i
许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在5 O  {; M+ U" S! Q, ~. z
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.
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     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉
. q/ H2 w  t3 ~/ N' z6 Z: B0 X' T0 ?

细胞干

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; c7 j& N. f1 J# I" M1 u9 I5 B8 Z
+ V/ _( b/ D9 c) S9 S2 S8 C- ]5 h是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

细胞干

回复 yingjie 的帖子5 n# |5 Y. @# J: d* d

, n  U5 o  y5 ]  Y我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。
! s" Q4 a; ~2 `9 y! q我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。3 B3 K7 }3 t4 r6 |7 s9 F
消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。
- {( ~5 `5 K' O+ k) b  U但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。; e3 S) ?  n- z
请问你是怎么做的，结果怎么样？
: i) A( N1 w+ @1 E

赵贵芳

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, W; z  X: |6 ?4 h% [" ^$ a7 U  {
2 B0 f; `5 c5 T% l# m' s请问是哪三种酶啊？

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的